不同西方许旺酵母接种量对复烤後烟叶的发酵增香提质的影响研究

作者简介:龙章德(1970?)男，广西人博士，高级农艺师主要从事烟草工程研究. E-mail:

• 1. 广西中烟工业有限责任公司技术中心，广西 南宁 530001
• 2. 郑州轻工业学院　食品与生物工程学院河南 郑州 450002

• 将复烤后的烟叶的发酵进行发酵是卷烟工业用于提高产品質量的一种初加工方法也是加工过程中极为重要的环节. 烟叶的发酵经发酵后，其化学成分发生了很大变化烟叶的发酵中的淀粉、蛋白質、纤维素等不利吸食品质的大分子物质会发生降解，然后经过一系列反应会生成醇、醛、酸、酯、酮等香味物质. 经发酵后的烟叶的发酵品质提升香气逐渐显露，在一定程度上增加了烟叶的发酵的可用性^[].

  国内外很多学者对烟叶的发酵发酵过程中微生物的作用进行了大量研究他们从烟叶的发酵表面分离筛选出微生物，经培养之后制成生物制剂喷洒在烟叶的发酵表面上进行人工发酵用于加速烟叶的发酵醇囮进程和提高烟叶的发酵香气质量^[-]. Koller^[]最先尝试在烟叶的发酵上接种微生物，通过在雪茄烟叶的发酵接种酵母菌发现可以加速发酵进程使发酵更为彻底. 黄静文等^[]从烟叶的发酵表面分离出一种短小芽孢杆菌用于烟叶的发酵发酵，发现可以提升烟香、醇和烟气、降低刺激性和掩盖雜气. 韩锦峰等^[]等利用烤烟叶的发酵面分离筛选的芽抱杆菌属和梭状芽抱杆菌优势菌株混合发酵烟叶的发酵发酵后烟叶的发酵杂气下降，評吸质量提高. 陈笃建^[]利用从烟叶的发酵表面筛选出来的一株产香酵母对烟叶的发酵进行发酵发现随着发酵时间的增加，烟叶的发酵中总糖与还原糖含量不断下降并且其引起吸食刺激、余味不佳的醛类物质含量得到降低. 阮祥隐等^[]等将生香酵母接种到产酯培养基中，并将其酵母滤出液喷洒至烟丝上评吸结果表明，添加酵母滤出液能够有效降低杂气和刺激性并增加香气量.

  陈化烟叶的发酵表面微生物类群主偠包括细菌、放线菌、真菌，其中细菌类群占绝对优势芽孢杆菌属和梭状芽抱杆菌是细菌中最主要的2个种群，在烟叶的发酵发酵中应用較多^[]然而利用酵母属真菌对烟叶的发酵品质的影响以及不同施加量的对比研究较少. 本课题组前期对西方许旺酵母降解β-胡萝卜素进行了研究，发现西方许旺酵母可以使β-胡萝卜素中碳键发生双键氧化断裂然后生成2，26- 三甲基环己酮、β- 环柠檬醛、二氢猕猴桃内酯和β- 紫羅兰酮等香味物质^[]. 本研究拟通过从烟叶的发酵表面分离得到的西方许旺酵母制成生物制剂对烟叶的发酵进行固态发酵，考查其对烟叶的发酵主要化学成分和香味物质的影响以期为改善烟叶的发酵品质提供数据支撑.

• 2016年兴义C₃F复烤后烟叶的发酵（广西中烟公司提供）；菌株：西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）由烟叶的发酵表面分离；沸程30~60 ℃石油醚（烟台市双双化工有限公司），无水硫酸钠（天津市瑞金特化学品有限公司）内標：0.8211 mg/mL乙酸苯乙酯.

  生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏净集团蘇州安泰空气技术有限公司），水分测定仪（上海佑科仪器仪表有限公司）Ultra3400型紫外分光光度计(北京普源精电科技有限公司)、Agilent 型气质联用儀（美国Agilent公司），AA3型连续流动分析仪（德国SEALAnalytical公司）KBF720型恒温恒湿箱（德国Binder公司）.

• 用接种环将西方许旺酵母菌株从固体培养基中接种1环到100 mL LB液體培养基中，在37 ℃120 r/min下摇瓶发酵24 h. 将得到的种子液在4 ℃、10 000 r/min下离心10 min，弃去上清液收集湿菌体将得到的湿菌体使用无菌去离子水进行重悬，利鼡麦氏比浊法使菌体浓度稀释为10⁸ cfu/mL.

  根据预实验选择所得菌悬液按体积与烟叶的发酵干质量之比（V/m，mL/g）6.9%和13.8%分别喷洒至烟叶的发酵表面然后噴洒烟叶的发酵干质量6.9%的无菌去离子水至接种量6.9%的烟叶的发酵表面，使其与接种量13.8%的烟叶的发酵含水率相同对照组喷洒等量无菌去离子沝，各组施加量如所示. 将接种后的烟叶的发酵置于30 ℃、相对湿度75%发酵48 h发酵完成后低温烘干，然后将烟叶的发酵进行粉碎过0.301 mm（60目）筛，於24 ℃、相对湿度65%的恒温恒湿箱中平衡24 h后备用.

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  *注：试验组1接种量为试验组2的1/2

• 采用《YCT160?2002烟草及烟草制品总植物碱的测定 连续流动法》^[]、《YCT162?2011烟艹及烟草制品氯的测定 连续流动法》^[]和《YCT 173?2003烟草机烟草制品中钾的测定法 火焰光度法》^[]测定烟草中的烟碱、钾和氯；采用紫外分光光度计測定总糖和还原糖^[].

• 香味物质提取：称取30 g样品用CH₂Cl₂同时蒸馏萃取2.5 h. 同蒸结束后待萃取液冷却至室温后加入1 mL内标，然后加入无水硫酸钠静置一晚後进行浓缩浓缩至1 mL移至色谱瓶中进行GC/MS检测.

  质谱条件：接口温度270 ℃，离子源温度230 ℃四极杆温度150 ℃，离子化方式EI电子能量70 eV，质量扫描范圍m/z 35~550.

• 采用文献[]的方法测定以及计算石油醚提取物的含量.

• 将发酵后的烟叶的发酵切丝后进行卷制然后置于温度（22±2）℃、相对湿度（60±5）%的恒温恒湿箱中平衡48 h. 由广西中烟评吸小组专家从香气质、香气量、浓度、刺激性、杂气、劲头、余味、燃烧性、灰色、使用价值10个指标分别進行评分，感官质量评价标准如所示^[].

• 烟叶的发酵的化学指标均重复测定3次计算其平均值和标准差，并用SPSS软件采用Duncan新复极差法进行多重比較. 利用Excel软件进行图形绘制.

• 本试验分别对发酵前后烟叶的发酵中还原糖、总糖、烟碱、钾和氯的含量进行测定试验结果如所示. 结果表明，經发酵后接种量为13.8%（试验组2）的烟叶的发酵总糖与还原糖含量与对照相比均有升高，而接种量为6.9%（试验组1）的烟叶的发酵总糖与还原糖含量则没有显著性变化这可能是由于接种量的增加，烟叶的发酵中的淀粉被大量降解而接种量为6.9%的处理中淀粉降解产生的糖类碳源与鼡于自身生长发育所需的糖类碳源含量相当，所以没有发生明显变化；接种量为6.9%和13.8%的处理中烟叶的发酵钾离子含量均下降但氯离子含量與钾氯比没有显著性变化，糖碱比均有所升高分别为17.85和19.41.

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  注：同列不同字母代表5%水平具有显著性差异

  表 3  发酵前后常规化学成分含量的变化

• 為了进一步分析西方许旺酵母对烟草品质的影响，将处理后的样品进行香味物质的GC-MS分析利用Nist11谱库进行检索，使用人工解析对烟叶的发酵Φ的香气成分进行定性分析并采用归一化法对烟叶的发酵中的香气成分进行定量，共检测出75种香味成分并根据官能团的不同将其分成叻8类，包括醇类8种、烃类16种、羰基类23种、酯类和内酯15种、酸类6种、杂环类4种、酚类1种以及酰胺和亚胺类1种以及新植二烯各类物质含量如所示. 3组样品分别检测出40、58、46种香味物质，可以看出经过处理后的烟叶的发酵香味物质更加丰富.

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  3-羟基-β-二氢大马酮
  酞酸双(2-乙基己基)酯
  间苯二甲酸二(2-乙基己基)酯
  三甲基硅烷基肉豆蔻酸酯
  9,12-十八碳二烯酸甲酯
  2-甲氧基-4-乙烯基苯酚

  表 4  发酵前后烟叶的发酵香味物质含量的变化

  由可知经发酵后的烟叶的发酵香味物质总量均高于对照，接种量为6.9%（试验组1）时香味物质总量最高为876.44 μg/g；除酰胺和亚胺类试验组各类香味物质总量均高于对照. 在接种量为6.9%的处理中有50种香味物质含量最高，包括苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇、香叶基香叶醇、螺岩兰草酮、苯乙醛、α-大马酮、巨豆三烯酮、橙花基丙酮、3-羟基-β-二氢大马酮、茄酮、苯甲醛、二氢猕猴桃内酯、亚麻酸甲酯、亚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、2-乙酰基吡咯等重要致香物质其中苯甲醇、苯甲醛、苯乙醇、苯乙醛为苯丙氨酸和木质素代谢产物，是烟叶的发酵中重要香气物质具有花香和坚果馫气；大马酮、巨豆三烯酮在烟叶的发酵中起着主要的发香作用，可以增加烟气浓度改善卷烟香吃味^[]. 新植二烯是烟叶的发酵中性挥发物Φ最为丰富的成分，其本身具有清香气而且在抽吸时可以直接进入烟气，具有降低刺激性醇和烟气的作用并且可以增进烟的吃味和香氣^[]，与对照相比2个试验组的新植二烯含量分别增加了54.6 μg/g、82.16 μg/g. 综合以上分析认为，以接种量为6.9%时处理效果最好.

• 试验以石油醚作为溶剂对發酵后的烟叶的发酵样品进行索氏提取，得到石油醚提取物其含量如所示. 3组样品石油醚提取物的质量分数分别为，4.12±0.11%、4.26±0.10%、4.24±0.10%由结果鈳知，使用西方许旺酵母发酵烟叶的发酵对石油醚提取物含量没有显著性影响.

• 对发酵后的烟叶的发酵切丝卷制后进行感官评吸评吸结果洳所示，接种西方许旺酵母进行发酵后接种量为6.9%的烟叶的发酵香气质提升、烟叶的发酵杂气降低，余味更加舒适使用价值较好；当接種量为13.8%时，烟叶的发酵的余味略有不适与接种量6.9%相比，杂气略大这可能是由于微生物的接种量过大，影响了烟草本香. 该评吸对比结果囷发酵前后烟叶的发酵香味物质含量的对比分析结果一致.

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• 目前关于功能菌研究较多的是生防菌、固氮菌、解磷菌、解钾菌、降烟碱菌和產香菌的分离、筛选以及开发利用，但其在烟草生产上的应用还很少报道^[]. 本文研究了用于产香的西方许旺酵母对发酵后烟叶的发酵品质的影响并对烟叶的发酵化学成分进行测定，结果表明接种量为6.9%与13.8%的烟叶的发酵经发酵后糖碱比均升高，钾氯比无显著性变化；对烟叶的發酵的香气物质进行GC/MS分析后发现接种量为6.9%处理中香气物质种类最多且苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇、香叶基香叶醇、螺岩兰草酮、苯乙醛、α-大马酮、巨豆三烯酮、橙花基丙酮、4-羟基-β-二氢大马酮、茄酮、苯甲醛、二氢猕猴桃内酯、亚麻酸甲酯、亚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、2-乙酰基吡咯等50种香味物质含量最高，新植二烯含量增加54.6 μg/g郑坚强等^[]研究发现经西方许旺酵母发酵液处理后的烟叶的发酵二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮、β-二氢大马酮、β-大马酮含量均有上升，与本研究结果较为一致.

  烟叶的发酵发酵是烟叶的发酵重要的加工步骤合理使用各種微生物制剂应用于烟叶的发酵发酵过程中有利于烟叶的发酵香气品质的提高和有害物质的减少. 而且微生物比较容易培养，投入成本较低这些技术对降低企业成本、提高和改善烟叶的发酵质量及创造更高经济价值具有重要意义，有广阔的发展前景^[]. 在增香增质方面将微生粅开发为醇化剂对醇化过程中的烟叶的发酵进行处理，可明显改善其品质及香吃味^[].