猪霍乱沙门氏菌C78_1株_crp缺失株的构建及其生物学特性初步研究95
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猪霍乱沙门氏菌C78_1株_crp缺失株的构建及其生物学特性初步研究95
畜牧兽医学报??):587??；ActaVeterinariaetZootech；猪霍乱沙门氏菌C78??1株??crp缺失株的构；及其生物学特性初步研究；郁??川,程相朝*,赵战勤,张春杰,李银聚,吴庭；(河南科技大学动物科技学院,洛阳471003)；摘??要:通过自杀性质粒介导的等位交换技术构建猪；关键词:猪霍乱沙门氏菌C78??1;c
畜牧兽医学报??):587??593ActaVeterinariaetZootechnicaSinica猪霍乱沙门氏菌C78??1株??crp缺失株的构建及其生物学特性初步研究郁??川,程相朝*,赵战勤,张春杰,李银聚,吴庭才(河南科技大学动物科技学院,洛阳471003)摘??要:通过自杀性质粒介导的等位交换技术构建猪霍乱沙门氏菌C78??1株的crp基因缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以猪霍乱沙门氏菌C78??1基因组为模板进行PCR,扩增出crp基因上下游片段(bp),并分别将其克隆入自杀性质粒pRE112上,构建含缺失320bpcrp基因的重组自杀性质粒pRE??crp。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术,两步法筛选C78??1的??crp缺失株。进一步的生物学特性研究表明,缺失株的血清型与亲本菌株C78??1一致,且能够稳定遗传缺失的crp基因,但其生化特性和生长速度与C78??1相比发生明显改变,小鼠致死性试验结果表明其毒力较C78??1降低约750倍。以上结果均证实,作者成功构建了猪霍乱沙门氏菌C78??1株的crp基因缺失突变株,缺失株遗传稳定,毒力显著降低,为进一步开发猪霍乱沙门氏菌的弱毒疫苗菌株奠定了基础。关键词:猪霍乱沙门氏菌C78??1;crp基因;重组自杀性质粒;接合转移;??crp缺失株中图分类号:S852.612????????文献标识码:A????????文章编号:(87??07ConstructionandCharacterizationofaSalmonellaCholeraesuisC78??1??crpDeletionMutantYUChuan,CHENGXiang??chao*,ZHAOZhan??qin,ZHANGChun??jie,LIYin??ju,WUTing??cai(CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China)Abstract:Inthisstudy,a??crpmutantofSalmonellaCholeraesuisC78??1wasconstructedbytheallelicexchangeintroducedbythetransductionofthepRE112suicideplasmidandcharacteristicsofthemutantwerealsodetermined.Firstly,theupstreamanddownstreamfragementsofcrpgenewereamplifiedfromSalmonellaCholeraesuisC78??1genomeandthensuccessivelysubclonedintosuicideplasmidpRE112toconstructtherecombinantsuicidevectorpRE??crpwith320bp??de??letedcrpfragment.Then,theC78??1??crpmutantwasconstructedthroughthetwo??stepmethodintroducedbythetransductionofrecombinantsuicideplasmid.TheOandHantigensofthemu??tantwas6,7:C:1,5,identicaltotheparentC78??1strain.Themutantwasstabilewiththere??combinant??crpgeneinvitro.However,fermentationpatternsandgrowthrateofthemutantweredifferedfromthatoftheparentC78??1strain,obviously.Themouselethaltestshowedthatthevirulenceofthemutantwas750timeslowerthanC78??1.TheseresultsshowedthattheC78??1??crpmutantwasconstructedsuccessfully.Itislikelythatthis??crpmutantcouldbeadaptedtodevelopattenuatedSalmonellavaccine.Keywords:SalmonellaCholeraesuisC78??1recoconju??a??crpmutant收稿日期:基金项目:河南科技大学博士基金资助项目作者简介:郁??川(1985??),男,河南安阳人,硕士生,主要从事动物疫病的分子与免疫学机制研究,E??mail:yu_*通讯作者:程相朝,E??mail:588畜??牧??兽??医??学??报-141卷??????猪霍乱沙门氏菌(SalmonellaCholeraesuis)是引起仔猪副伤寒的主要病原之一,可引起断奶仔猪大批发病,常因伴发或继发其它疾病或治疗不及时而大批死亡,给养猪业造成重大损失。动物生前感染或食品受到污染,可使人发生食物中毒,在公共卫生上也具有十分重要的意义[2]。疫苗接种是防控仔猪副伤寒的最适宜策略。沙门氏菌作为一种侵袭性胞内菌,其减毒后具有有限的侵袭潜能,在体内生长缓慢,能够有效地持续刺激机体产生强有力的细胞免疫和体液免疫以及局部黏膜免疫,因此,减毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活苗或亚单位苗更为有效。在我国,研制仔猪副伤寒活疫苗比较成功的是有关专家将抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌强毒株C78??1接种含有醋酸铊的培养基中传数百代后,选出了免疫原性良好的弱毒株C500。但该菌株是经化学方法传代致弱,对其致弱的遗传背景和引起免疫保护的机理目前仍不清楚。另外,该疫苗菌株具有一定的残余毒力,且存在毒力返强的风险[8]。随着现代生物学和DNA重组技术的发展,以及对沙门氏菌毒力遗传学研究的不断深入,近年来通过基因工程方法减毒沙门氏菌作为口服疫苗及其作为疫苗活载体表达外源抗原受到了极大的关注。目前,基因工程致弱技术被广泛应用于鼠伤寒沙门氏菌与人伤寒沙门氏菌,但猪霍乱沙门氏菌的相关报道很少。作者选择crp(cAMPreceptorprotein,crp)基因作为目的基因,运用重组自杀性质粒介导细菌的等位交换技术获得猪霍乱沙门氏菌C78??1株crp基因缺失突变株,并对其生物学特性进行了初步研究,从而为研制更加安全有效的猪霍乱沙门氏菌疫苗弱毒株奠定基础。[9][5??7][4][3][1]100!g#mL的氨苄青霉素(Amplicillin,Amp),终浓度25!g#mL-1的氯霉素(Chloramphenicol,Cm),??7213培养时加入二氨基庚二酸(DL???,#??Diaminopimelicacid,DAP),终浓度50!g#mL1.2??培养基、试剂和实验动物-1。麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基及各种生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司;LB培养基购自美国BD公司。沙门氏菌属诊断标准因子血清购自兰州生物制品所;DAP、蔗糖购自美国Sigma??Aldrich公司;DNAMarker、PyrobestDNAPolymerase、T4DNALigase和限制性内切酶等购自大连TaKaRa公司;基因组提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自上海捷瑞生物公司。6周龄雌性SPF级KM小鼠(20g?2g)购自郑州大学实验动物中心。1.3??引物本试验所用的引物见表1。根据GenBank上已公布的鼠伤寒沙门氏菌LT2(GenBankNo.AE008859)crp基因序列和文献[8]设计crp基因相关引物。根据鼠伤寒沙门氏菌invA基因序列选择特异性引物Pi1、Pi2[10],直接从培养过夜的SS琼脂平板上挑取单菌落用于扩增鉴定沙门氏菌。各引物均由上海生物工程公司合成。1.4??重组自杀性质粒pRE??crp的构建按试剂盒说明提取猪霍乱沙门氏菌C78??1株的基因组为模板,使用引物P1/P2扩增1048bp的crp基因上臂片段crp1,回收、连接pMD18??T载体,测序正确后用BamH%和Xba%双酶切,回收crp1并将其克隆到pBluescriptSK(+)载体,构建重组质粒pSKcrp1。按同样的方法使用引物P3/P4扩增1743bp的crp下臂片段crp2,并将其克隆到pSKcrp1重组质粒,构建重组质粒pSK??crp。测序正确后,再用Kpn%和Xba%双酶切,回收串联的crp1+crp2融合片段??crp并将其克隆到自杀性质粒pRE112上,转化大肠杆菌??7213,构建含缺失320bpcrp基因片段的重组自杀性质粒pRE??crp。1.5??猪霍乱沙门氏菌??crp缺失株的构建根据文献[11]和[12]的方法,通过重组自杀性质粒介导细菌基因接合转移的作用,二步法筛选缺失基因突变株。以??7213(pRE??crp)为供体菌,C78??1为受体菌进行接合转移。供体和受体菌分别培养过夜,各取100!L菌悬液混合培养过夜,涂布含Cm和蔗糖的LB固体平板上培养,挑取Cm抗性(Cm)蔗糖r1??材料与方法1.1??菌株、质粒和细菌培养条件猪霍乱沙门氏菌标准强毒株C78??1购自中国兽医药品监察所。pBluescript??SK(+)质粒及其宿主菌大肠杆菌JM109由本实验室保存;自杀性质粒pRE112(oriToriV??asdCmSacB)及其宿主菌大肠杆菌??7213(Thi-1thr-1leuB6fhuA21lacY1glnV44??asdA4recA1RP42??Tc Mu[ pir]Km)由Dr.RoyCurtiss!教授馈赠,本实验室保存。大肠杆菌和沙门氏菌在LB培养基中37?静止(固体)或振摇(液体)培养,根据需要加入终浓度rr??5期s郁??川等:猪霍乱沙门氏菌C78??1株??crp缺失株的构建及其生物学特性初步研究s589敏感(SUC)菌落,用引物T1/T2扩增鉴定。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB(NB)液体培养基中培养过夜,连续10倍稀释,选取合适的稀释度涂布含5%表1??PCR扩增引物序列Table1??TheprimersequencesforPCRamplification扩增基因GeneamplifiedUpstreamofcrpDownstreamofcrpcrp/??crpcrp/??crpinvA引物PrimerP1P2P3P4T1T2T3T2Pi1Pi2蔗糖的NB固体平板,筛选Cm敏感(Cm)蔗糖抗性(SUCr)菌落。提取基因组,用T1/T2扩增鉴定,阳性缺失株进一步用T2/T3扩增鉴定。序列(5&?3&)Sequence(5&?3&)GCTCTAGAGCTGGATGAGAGTTTTGTGGTCGGATCCCCATTCAAGAGTCGGGTCTTTCTCGTCGCTTACAAGTCACCTGGTACCCAGTAACTGGATGGTGTATATACGCGCATACAACAAAAGTCGCGCCATTCTGACGGAATTAACGGGTCGCGTACCCATATCAACTTGCCATTCTGACGGAATTAACGGGCAGGATACCTATAGTGCTGCCGCACCGTCAAAGGAACCGT限制性酶切位点RestrictionsiteXba%BamH%Xho%Kpn%1.6??缺失菌株??crpC78??1的生物学特性研究1.6.1??缺失菌株??crpC78??1的表型鉴定????将缺失菌株??crpC78??1与亲本菌株C78??1划线接种含和不含1%麦芽糖的麦康凯平板,然后转接葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇等生化鉴定管,并进行O和H抗原等相关血清型鉴定。1.6.2??缺失菌株??crpC78??1的遗传稳定性????将缺失菌株??crpC78??1于LB固体培养基中连续盲传20代,挑取第5、10、15、20代单菌落,T2/T3PCR扩增鉴定,观察crp缺失基因在??crp突变株中的遗传稳定性。1.6.3??缺失菌株??crpC78??1的生长特性????缺失菌株??crpC78??1与亲本株C78??1在LB中37?培养过夜,生理盐水连续10倍稀释,选择合适的稀释度,取100!L在LB平板上均匀涂开,并做3个重复,37?培养过夜,计数,取平均值,并计算原液的CFU。转接使终浓度约为106CFU#mL-1,37?100r#min-1培养,每1h取样平板计数,绘制生长曲线。1.6.4??缺失菌株??crpC78??1对小鼠的毒力试验????缺失菌株??crpC78??1与亲本菌株C78??1在LB中37?培养过夜,按1.6.3方法计数,无菌生理盐水连续5倍稀释,选取合适的稀释度,每个稀释度腹腔注射5只KM小鼠,另设无菌生理盐水阴性对照,每只500!L,观察30d。死亡小鼠肝脏无菌接种SS琼脂平板,用Pi1/Pi2扩增鉴定,统计出每组死亡情况,根据Bliss法计算LD50。M.DNAmarker(DL10000);1.pRE??crp/BamHI+XbaI;2.pRE??crp/KpnI+XbaI图1??重组质粒pRE??crp的酶切鉴定Fig??1??EnzymeidentificationofplasmidpRE??crp2??结果与分析2.1??重组自杀性质粒pRE??crp的构建重组自杀性质粒pRE??crp的酶切鉴定如图1所示,Kpn%和Xba%双酶切该质粒呈2条带,与预期5170bppRE112质粒和2791bp??crp片段一致。利用crp2内部的BamH%酶切位点,BamH%和Xba%双酶切可见3条带,分别为将??crp融合基因切开的2条较小的带及最大片段的质粒条带(如图1),与预期大小均一致。最终的测序结果也表明,重组自杀性质粒pRE??crp构建完全正确。2.2????crpC78??1缺失株的筛选??7213(pRE??crp)与C78??1接合转移后,发生同源臂间的单交换,自杀性质粒pRE??crp被整合到C78??1染色体上,阳性接合子表型为CmSUC。由于自杀性质粒pRE??crp被整合到染色体上,crp有2个拷贝,一个是缺失型,一个是野生型,因此用一条上臂内部引物T1和一条下臂内部引物T2扩增出2个片段,野生型是918bp,缺失型是599bp(如图2A)。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB(NB)培养基中连续传代培养,发生第2次同源重组,产生rs2种结果,一种是突变型,大小为599一种是恢复野生型,大小为918bp(如图2B)。T1和T2扩增正确后,为了进一步证明扩增出的缺失片段是发生在染色体而不是重组自杀性质粒上,阳性缺失株用后臂内部引物T2和前臂以外染色体上的一条引物T3扩增鉴定,缺失株扩出1412bp片段,野生型扩出1731bp片段,pRE??crp扩不出任何条带(如图2C)。由PCR鉴定结果可知,筛选得到的CmSUC接合子为正确的crp基因缺失株。srA.引物T1、T2的鉴定结果:1.水对照;2.pRE??crp对照;3.C78??1对照;4.??crp缺失株;M.DL2000DNA相对分子质量标准;B.引物T1、T2的鉴定结果:M.DL2000DNA相对分子质量标准;1.水对照;2.野生型;3.??crp缺失株;C.引物T2、T3的鉴定结果:M.DL2000DNA相对分子质量标准;1.pRE??crp对照;2.水对照;3.C78??1对照;4.??crp缺失株A.PCRidentificationof??crpmutantconjugantswithT1andT2.1.ddH2O2.pRE??3.C78??1con??4.??M.DL2000DNALB.PCRidentificationof??crpmutantswithT1andT2;M.DL2000DNAL1.ddH2O2.Wide??3.??C.PCRidentificationof??crpmutantswithT2andT3.M.DL2000DNAL1.pRE??2.ddH2O3.C78??14.??crpmutant图2??PCR鉴定??crp缺失株Fig??2??PCRidentificationof??crpmutant2.3??缺失菌株??crpC78??1的生物学特性2.3.1??缺失菌株??crpC78??1的表型鉴定????亲本菌株C78??1能够利用麦芽糖,在加麦芽糖的麦康凯琼脂上呈红色菌落。构建的缺失菌株??crpC78??1缺失crp基因后,不能利用麦芽糖,因此在加麦芽糖的麦康凯琼脂上仍呈无色菌落(图3)。进一步的生表2??缺失菌株??crpC78??1与亲本菌株C78??1生化特性的比较化鉴定结果表明,与亲本菌株C78??1相比,缺失菌株??crpC78??1的生化特性发生了明显改变。??crpC78??1失去了利用麦芽糖、蔗糖、果糖与甘露醇等碳源的能力,也不能分解H2S,但保留了利用葡萄糖的能力(表2)。??crpC78??1的血清型仍为6,7:C:1,5,与亲本菌株C78??1相同。Table2??Comparisonofthebiologicalcharacterizationbetweenthe??crpmutantandC78??1菌株StrainsC78??1??crpC78??1Glu++Mal+-Suc--Lac--生化特性BiologicalFruXyl++--characterizationRaManRha+++---H2S+-MR++VP--Glu.GMal.MSuc.SLac.LFru.FXyl.XRa.RMan.MRha.RH2Sintriplesugarironagar2.3.2??缺失菌株??crpC78??1的遗传稳定性????缺失菌株??crpC78??1在LB固体培养基上连续培养20代,挑取第5、10、15、20代的单菌落,应用引物T2/T3PCR扩增鉴定。结果显示,都能扩增出缺失型的1412bp的??crp片段,亲本株C78??1扩增出野生型的1731bp的crp片段(图4),表明缺失菌株示,缺失株??crpC78??1的生长速度明显慢于亲本株C78??1。1.C78??1在含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基;2.C78??1在麦康凯琼脂培养基;3.??crpC78??1缺失株在含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基;4.??crpC78??1缺失株在麦康凯琼脂培养基1.C78??1onMacConkeyagarplus1%2.C78??1onMacC3.??crpC78??1mutantonMacConkeyagarplus1%4.??crpC78??1mutantonMacConkeyagar图3??缺失菌株??crpC78??1与亲本菌株C78??1在麦康凯琼脂培养基(含1%麦芽糖)上的生长情况Fig??3??Thegrowthof??crpC78??1mutantandparentC78??1strainonMacConkeyagarplus1%maltose图5??缺失菌株??crpC78??1与亲本菌株C78??1的生长曲线Fig??5??Thegrowthcurvesof??crpC78??1andC78??12.3.4??缺失菌株??crpC78??1的小鼠毒力试验????各试验组KM小鼠腹腔接种后,引起动物的死亡情况见表3。注射无菌生理盐水的小鼠均未发生死亡,??crpC78??1和C78??1接种组小鼠均发生了死亡。死亡小鼠剖检可见肝、脾肿大,有灶性坏死,肠系膜充血,肠内多液体、气体。采取各组死亡小鼠的肝脏并无菌接种SS琼脂,分离到无色透明针尖大小的菌落,用引物Pi1/Pi2扩增鉴定沙门氏菌,均扩增出580bp的特异性DNA条带(图6)。血清型鉴定结果表明,分离细菌的抗原式均为6,7:C:1,5,因而可以确定小鼠的死亡是感染猪霍乱沙门氏菌所致。根据Bliss法计算??crpC78??1和C78??1的LD50,分别为6.6(10和8.8(10CFU,表明缺失菌株??crpC78??1较亲本菌株C78??1的毒力降低了约750倍。63??crpC78??1能够稳定遗传缺失了320bp的crp基因片段。M.DL2000DNA相对分子质量标准;1.水对照;2.C78??1对照;3~6.第5、10、15、20代??crpC78??1缺失株M.DL2000DNAL1.ddH2O2.C78??13??6.The5th,10th,15thand20thgenerationof??crpC78??1mutant图4??引物T2和T3PCR鉴定缺失菌株??crpC78??1的稳定性Fig??4??PCRidentificationofstabilityof??crpC78??1mu??tantwithT2andT32.3.3??缺失菌株??crpC78??1的生长特性????分别挑取缺失菌株??crpC78??1与亲本菌株C78??1单菌落,划线接种于麦康凯培养基,37?培养12h后,缺失菌株??crpC78??1与亲本菌株C78??1的平均菌落直径分别为0.4和0.8mm。缺失菌株??crpC78??1与亲本菌株C78??1从106CFU#mL-1开始培养,每1h取样,平板计数,绘制生长曲线(图5)。结果显M.DL2000DNA相对分子质量标准;1.水对照;2~8.来自接种小鼠的沙门氏菌分离株M.DL2000DNAL1.H2O2??8.Salmomellaisolatesfrominoculatedmice图6??沙门氏菌的PCR扩增鉴定Fig??6??PCRidentificationofSalmomella包含各类专业文献、文学作品欣赏、中学教育、行业资料、高等教育、生活休闲娱乐、专业论文、猪霍乱沙门氏菌C78_1株_crp缺失株的构建及其生物学特性初步研究95等内容。　
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