1、楿差显微镜观察法 2、FDA染色法 3、伊凡蓝染色法

FDA染色法：是测定原生质体活性的一种方法即荧光素双醋酸酯染色，FDA本身无荧光

进入原生质體后便产生荧光素，它不能自由进入原生质体膜因此有活力的细胞便产生荧光。

原生质分离酶，纤维素酶离析酶。

步骤：叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原

生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗→離心→清洗基质两次

→重悬浮于培养基→除去小的个体用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。

1、原生质体分离后非常脆弱，需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成

2、针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整

影响原生质體培养的因素，营养需求（NH4+不能过多）渗压剂培养密度（105/mL）

贮藏条件（通常在黑暗处）。

培养方法:液体基质培养法,半液体基质培养法,固體基质培养法,看护培养

固体培养的步骤,原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖

(40℃)的培养基混和→倒转培养皿在25℃下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细

胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养,培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱

原生质体分离培养的意义：

1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路

2、原生质体可摄入外源DNA,細胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础

3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。

取洗涤过的原生质体悬浮液 0.5ml置于10×100mm的小试管中加入 FDA溶液使其最终浓度为 0.01混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24?压淛滤光片用JB8发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荣光的为无活力的由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的发红色荧光的为无活力的。

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