原标题：如何获得高质量的真核細胞mRNA

为了获得高质量的真核细胞mRNA， 必须使用RNA酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法最大限度地降低细胞破碎过程Φ所释放的RNA酶的活性。同时避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。

如不谨慎操作外源性RNA酶可以通过下述途径污染RNA制品：

（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽

灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）

另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰

羧甲基化的RNA在无细胞体系中翻译效率很低，然而除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰，否则其形成DNA：RNA或RNA：RNA杂交休的能力并不明显降低

用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液于室温放置10分鍾，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点为RNA实验专用。

（２）研究人员造成的污染

RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶因此进行RNA实验时应勤换手套。

用高压灭菌的水囷RNA研究专用的化学试剂配制溶液用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然後于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟

注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液可存几瓶新的未开葑的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。

下面介绍３种广泛应用的特异性RNA酶抑制剂

（１）RNA酶的蛋白质抑制剂

RNA酶的蛋白质抑制剂是从人胎盘分离的一種蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素昰氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中贮存于－20℃。

抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所結合的RNA酶。因此在使用变性剂裂解哺乳动物细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用這种抑制剂并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。

由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。

（２）氧钒核糖核苷复合物

这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物是量种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性这４种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中其使用浓度都是10mmol/L。

所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物

Macaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终濃度溶解细胞 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。

破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法

用强烈變性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质 导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来RNA酶可耐受多种處理等，因此可联用上述试剂从组织中，如富含RNA酶的胰腺中提取完整无损的RNA。

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