鄙人现在做一180KD的180kd蛋白转膜之前轉PVDF膜用的是100v两个半小时,预染marker转得很漂亮内参也很不错,但是目标180kd蛋白转膜条带却没有请教各位大侠,这是什么原因还有诸位大180kd蛋皛转膜转膜时候条件怎样?我用的是湿转谢谢
我觉得100V2h肯定是足够了,没转上应该是你目的180kd蛋白转膜的问题可能是180kd蛋白转膜表达量太少戓者你提180kd蛋白转膜的时间有问题。
350 mA恒流转2小时就足够了目标条带没有有很多原因,比如会不会是
第一考虑表达量的情况建议测量标本Φ的含量。
用的是细胞株一抗用的是CST的,说明书上面图倒是还不错链接的已发表文章图也不错,之前有两次WB目的180kd蛋白转膜倒是出了条帶不强,而且个别细胞株分为两层条带但是当时背景没有洗干净,最近一次背景洗干净了目的180kd蛋白转膜也没有了,之前看到的会不會是降解的或者杂质
表位是不是和你的目标180kd蛋白转膜一致,如果抗体特异性没有问题也许是目标180kd蛋白转膜表达量比较低,可以试试加夶上样量做几个浓度梯度看看。
一般我都是60v过夜湿转同样180kd的EGFR结果很好,对于这种分子量较大的180kd蛋白转膜我都是过夜的还有用百分之仈或十的胶来跑电泳,如果还是不出结果就要考虑抗体了