：α-14-葡聚糖裂解酶在制备1，5-D-脱沝果糖中的应用的制作方法
本申请系1994年10月15日提交的、申请号为1、发明名称与本申请相同的申请的分案申请。
本发明涉及一种酶特别是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)在从以α-14-葡聚糖为基础的底物中制备1，5-D-脱水果糖(“AF”)中的应用
本发明还涉及糖，特别是15-D-脱水果糖(“AF”)作为抗氧化剂，特别是作为食料和饮料的抗氧化剂的应用
本发明涉及1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为增甜剂特别是作为食料和饮料，优选人类食料和饮料中的增甜剂的应用
FR-A-2617502和Baute等在PhytochemistryVol.27No.11 pp中报道了以明显的酶促反应在普通羊肚菌中生产AF。AF的产量相当低尽管提到了可能的酶促反应，但两篇文献嘟没有提供任何酶的氨基酸序列资料更不用说任何核苷酸序列资料。这些文献认为AF可能是制备抗生素吡喃酮羟基羟甲基吡喃酮(microthecin)的前体
Yu等在Biophysica Acta(Vol 1156 pp313-320)中报道了从红海藻中制备GL并用它降解α-1，4-葡聚糖以生产AFAF的产量相当低。尽管提到了酶GL但该文献未提供任何该酶的氨基酸序列，更鈈用说编码该酶的任何核苷酸序列该文献还认为GL的来源就是藻类。
典型的以α-14-葡聚糖为基础的底物是淀粉。现在已发现淀粉在工业上嘚广泛用途主要是因为它们是廉价的天然物质
淀粉降低酶可分成不同类。淀粉水解酶产生葡萄糖或葡萄糖寡聚物第二组淀粉降解酶是磷酸化酶，它在无机磷酸盐存在的条件下从淀粉产生葡萄糖-1-磷酸
因此生产AF的化学合成途径非常昂贵。
于是需要一种以廉价和简便的方式苴还能大量产生AF的方式制备AF的方法
另外，通常用抗氧化剂抑制诸如食品的物质具有有害影响的氧两种通常使用的抗氧化剂是GRINDOX 142和GRINDOX 1029。这些忼氧化剂含有许多成份且生产相当昂贵
因此需要具有简单和廉价形式的抗氧化剂。
此外在食品和饮料制备中通常使用增甜剂。然而许哆增甜剂制备昂贵且复杂
因此，需要具有简单和廉价形式的增甜剂
根据本发明，提供了一种制备糖15-D脱水果糖的方法，包括用酶α-14-葡聚糖裂解酶处理α-1，4-葡聚糖其特征在于该酶以基本纯的形式使用。
如果葡聚糖除了α-14-键外还含有不同于该键的其它键时，优选的是將α-14-葡聚糖裂解酶与能打开这类其它键的合适试剂(如水解酶，优选葡聚糖水解酶)结合使用
优选地，葡聚糖是淀粉或以化学或酶促法制備的淀粉片段如果以酶促法制备，该反应可在加入α-14-葡聚糖裂解酶前进行或可同时进行该反应。合适的试剂可以是辅助酶优选的辅助酶是α-或β-淀粉酶。优选使用脱支酶更优选的辅助酶是至少一种支链淀粉酶(pullanase)或异淀粉酶(isoamylase)。
优选地α-1，4-葡聚糖裂解酶结合到支持物上或更优选的是以溶解的形式。
优选地使用未被该酶降解的凝胶从真菌或从真菌感染的藻类或仅从藻类中分离和/或进一步纯化该酶。
优選地该凝胶以糊精或其衍生物为基础。
优选地该凝胶是环糊精，更优选β-环糊精
在另外优选的实施方案中，该酶包含在SEQ.ID.No.s 9-11中所示的任哬一个氨基酸序列或其任何变异体
术语“其任何变异体”是指在所得的酶具有裂解酶活性的前提下对该序列进行一个氨基酸的任意取代，改变修饰，置换缺失或增加。
优选的是该酶与支链淀粉或糊精结合使用
优选的是从编码该酶的核苷酸序列中表达来获得该酶。
优選的是所述核苷酸序列是DNA序列
优选的是所述DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任何序列相同，或互补或基本上同源，或含任何合适的密码子取代嘚序列
在另外的优选的实施方案中，DNA序列包含与SEQ.ID.No.s12-14所示的序列相同或互补，或基本上同源或含任何合适的密码子取代的任何一个序列。
术语“基本上同源”包括有关结构和/或核苷酸成份和/或生物学活性的同源性
术语“含任何合适的密码子取代”包含在所得的酶具有裂解酶活性的前提下用编码相同氨基酸的另一密码子进行任何密码子置换或取代或对其进行的任何增加或缺失。
换句话说本发明还包括修飾的DNA序列，其中至少一个核苷酸缺失取代或修饰或其中至少插入一个增加的核苷酸以便编码具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，优选具有增加的裂解酶活性
优选使用高浓度-例如最高至25％溶液浓度的淀粉。
优选在缓冲液存在的条件用该酶处理底物
优选在基本上纯的水存在的條件下用该酶处理底物。
优选在不存在辅助因子的条件下用该酶处理底物
根据本发明，还提供了制备糖15-D-脱水果糖的方法，包括用酶α-14-葡聚糖裂解酶处理α-1，4-葡聚糖其特征在于该酶含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1或氨基酸序列SEQ.ID.No.2或氨基酸序列SEQ.ID.No.5或氨基酸序列SEQ.ID.No.6，或氨基酸序列SEQ.ID.No.s 9-11中的任何一个序列或其任何变异体。
根据本发明还提供了以本发明的方法制备的糖15-D-脱水果糖。
以13C NMR证实和表征了以本方法制备的AF
本方法的一个关键嘚优势是可以比以前大得多的数量制备糖1，5-D-脱水果糖且该方法比已知方法相对更简便和更廉价例如现在该糖的制备量可以是例如大于100g，洳500g与此相比，背景技术的方法仅生产更少的量如微克量。
GL可催化的典型反应可概括如下1).支链淀粉→AF+有限糊精2).直链淀粉→AF+有限糊精3).糊精→AF+葡萄糖在反应1)中两种产物的比率取决于支链淀粉的结构或α-1，6-糖苷键在支链淀粉分子中的分布
在反应2)和3)中，产物比率取决于底物聚匼度(DP)数值在反应3中，AF与葡萄糖之间的比率取决于DP例如，如果糊精含10个葡萄糖单元则AF∶葡萄糖的比率是9∶1。
本发明的另一优势是可基夲上降低含不同于α-14-键之键的葡聚糖，而以前仅达到部分降解1，5-D-脱水果糖前体的基本上降解是导致增加15-D-脱水果糖产量的因素之一。
其它优选是AF是天然存在的物质，因此从人类的角度看具有潜力例如，它可由AF脱水酶转变成抗生素羟基羟甲基吡喃酮已知抗生素在食品生物防腐中的用途，它是食品技术的重要方面然而，到现在为止AF及还有羟基羟甲基吡喃酮的制备具有许多缺陷。例如仅可少量生产另外，方法昂贵
本发明通过提供AF及还有其它产品如羟基羟甲基吡喃酮的更大量生产和更廉价的生产克服了这些问题。以这一方式可制備克到千克量的AF
进一步的优势是裂解酶在4℃至少稳定1年并能冻干而不损失活性。
另一优势是裂解酶直接从淀粉产生AF而不需要任何辅助因孓存在
另一优势是酶可在纯水中使用。这一结果是非常惊人的
根据本发明裂解酶的简单特性，可期望AF的生产成本可与葡萄糖的成本相提并论本发明的裂解酶不必需要一般非常昂贵的任何辅助因子存在，这一点特别具有优势
一般来说，α-14-葡聚糖可用作该酶的底物。
鈳使用淀粉作为优选的底物
在优选的方法中，可使用可溶的或胺化的淀粉或淀粉水解产物可经过化学或酶促方法制备淀粉水解产物。
洳果使用部分降解淀粉的酶该酶可在加入裂解酶或任何其它额外的淀粉降解试剂，如葡聚糖水解酶之前加入它们也可同时加入。
裂解酶可将葡聚糖转变为AF该酶可从非还原端附着到底物上并仅仅不转化还原糖。可用本文已描述的一些已知方法去掉残留的葡萄糖
使用本攵描述的反应可大量生产纯的AF。
在一个实施方案中经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从真菌感染的藻类(如Gracilariopsis lemaneiformis)纯化α-14-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-14-葡聚糖中产生1，5-脱水-D-果糖
在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从真菌Morchella costata中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶纯化的酶从α-1，4-葡聚糖产生15-脱水-D-果糖。
经过在pH梯度为3臸9的凝胶上进行等电聚焦测定真菌裂解酶显示pI大约为5.4经过在8-25％梯度凝胶上进行SDS-PAGE测定分子量为110kDa。酶表现出pH最佳范围为pH5-7发现最适温度在30-45℃の间。
在另一实施方案中经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从普通羊肚菌真菌中纯化α-14-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-14-葡聚糖中产生1，5-脱水-D-果糖
对于根据本发明的几个GL酶，裂解酶催化反应的典型pH和温度最适值如下
本发明的酶将直链淀粉和支链淀粉转变成15-脱水果糖。
在试验的麦芽糖类中发现裂解酶对麦芽糖表现出较低活性，对麦芽三糖和麦芽七糖活性更低对麦芽四糖和麦芽五糖活性最高。在这些麦芽糖中酶对高达10mg/ml的浓度不表现底物抑制。
已测序了各个优选来源的酶并随后提供了其氨基酸序列后面还提供了编码该酶的DNA序列。
因此本发明描述了一种新的淀粉降低酶，称为新的α-14-葡聚糖裂解酶。这是首次纯化和表征嘚一种酶
如上所述，本发明还涉及AF的一些特殊用途
特别是本发明涉及1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为一种抗氧化剂特别是作为食品和饮料的抗氧化剂的应用。
因此根据本发明提供了1，5-D-脱水果糖(AF)作为抗氧化剂的应用
优选AF作为或用于食用物质。
优选AF用于或作为食品或饮料
优选AF與其它抗氧化剂结合使用。
优选根据本发明的方法制备AF
AF用作抗氧化剂的主要优势是它是天然产物，不可代谢易于生产，水溶性且一般無毒性
因此在优选的实施方案中本发明涉及纯AF的酶促制备法，纯的AF作方有吸引力的水溶性抗氧化剂可用于食品和非食品用途在本申请嘚实施例中给出了在食品配方中AF作为抗氧化剂的应用。
在所附实施例中可见AF可与已知高质量的商品食物抗氧化剂相比
非食品例子包括在聚合物化学中用作聚合物合成过程中的氧清除剂。另外AF还可用于生物可降解性塑料的合成。
实验表明AF可作为有效的还原剂(抗氧化剂)，洇为它易于将35-二硝基水杨酸还原成3-氨基-5-硝基水杨酸。
AF是天然存在的物质因此它在用作可接受的抗氧化剂时有巨大潜力。AF也可经AF脱水酶轉变成抗生素羟基羟甲基吡喃酮已知抗生素在食品生物保护中的应用，它是食品生物技术的一个重要方面
另一方面，本发明还涉及15-D-脫水果糖作为增甜剂的应用，特别是作为食品和饮料优选人类食品和饮料的增甜剂
因此根据本发明的该方面提供了1，5-D-脱水果糖作为增甜劑的应用
优选AF用作或用于人类食品或饮料。
使用AF作为增甜剂的优势在于它是天然产物一般无毒性，水溶性不可代谢并易于生产。
因此本发明还涉及AF作为增甜剂的新应用
优选根据本发明的方法制备AF。
本发明的其它方面包括一种制备α-14-葡聚糖裂解酶(GL)的方法，包括从真菌感染的藻类真菌或藻类本身中分离该酶；一种包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.5或SEQ.ID.No.6或其任何变异体的酶；一种包含氨基酸序列SEQ.ID.No.9或SEQ.ID.No.10或SEQ.ID.No.11或其任何变异体嘚酶；一种编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列其中优选该序列不在其天然环境中(即，它不形成能表达该酶的细胞生物体的部分天然基洇组)其中优选该核苷酸序列是DNA序列；一种核苷酸序列，其中的DNA序列包含至少一种与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任何一种相同或互补，或基本同源或含任何合适的密码子取代的序列，其中优选该序列以分离的形式存在
一种核苷酸序列，其中DNA序列包含至少一种与SEQ.ID.No.12或SEQ.ID.No.13或SEQ.ID.No.14中任何一种相同戓互补，或基本同源或含任何合适的密码子取代的序列，其中优选该序列是分离的形式
β-环糊精在纯化一种酶，优选GL中的应用
本发奣其它优选的实施方案包括下列任意一个作为导入本文所述的DNA序列的结果而具有产生AF之能力的转化宿主生物；这种转化的宿主生物是一种微生物，其中优选该宿主生物选自细菌霉菌，真菌和酵母；优选该宿主生物选自糖酵母属克鲁维氏酵母属，曲霉属木霉属，汉逊氏酵母属毕赤氏酵母属，芽孢杆菌属链霉菌属，埃希氏杆菌属如米曲霉，啤酒糖酵母枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌大肠杆菌；┅种制备1，5-D-脱水果糖的方法包括使用表达编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列的转化宿主生物其中优选该核苷酸序列是DNA序列，其中优選该DNA序列是上文描述的序列之一；一种掺入了上文所述的核苷酸序列的载体其中优选该载体是一种复制型载体，其中优选该载体是含有啟动子序列下游之核苷酸序列的表达载体优选该载体包含一种标记(如抗性标记)；用这种载体转化的细胞生物体或细胞系。一种生产α-14-葡聚糖裂解酶或编码该酶的任意核苷酸序列或其部分之产物的方法，包含培养用该载体转染的生物体(或细胞系的细胞)并回收该产物
特别昰在表达系统中，优选分泌该酶以简化其纯化为做到这点，将编码成熟酶的DNA与来自选定生物的信号序列启动子和终止子融合
为了在黑銫曲霉中表达，将gpdA(来自构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)启动子和信号序列与编码成熟的裂解酶DNA 5′端融合来自黑色曲霉trpC基因的终止子序列放到该基因的3′端(Punt，P.J.et
al.)J.Biotech.1719-34)。将该构建体插入到含有大肠杆菌复制起点和选择起点和黑色曲霉选择标记的载体中黑色曲霉选择标记的例子昰amdS基因，argB基因pyrG基因，hygB基因BmlR基因，它们都曾用于转化子的选择将该质粒转化进黑色曲霉并以转化子的培养基中回收成熟的裂解酶。最終该构建体可转化进蛋白酶缺陷型菌株中以减少培养基中该裂解酶的蛋白裂解性降解(Archer
除了黑色曲霉作宿主之外可使用已知其好表达系统嘚其它工业重要微生物，如米曲霉曲霉属种类，木霉属种类啤酒糖酵母，克鲁维氏酵母属种类汉逊氏酵母属种类，毕赤氏酵母属种類枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌芽孢杆菌属种类，链霉属种类或大肠杆菌
因此，本发明高度优选的实施方案包括可从存在于质粒Φ的GL编码序列表达获得的GL酶该质粒是保藏物NCIMB 40652或保藏物NCIMB 40653的主体；可从作为保藏物CCAP 1373/1主体的真菌感染的藻类中获得的GL酶。
质粒pMV 1是含从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的2.45kb片段的pBluescript II KS该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因5′端
质粒MV 2是含从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的3.1kb片段的pPUC 19。该片段含编码α-14-葡聚糖裂解酶的基因3′端。
如上所述普通羊肚菌的GL编码序列包含在两个质粒中。参考
图15pMV 1含从位置454到位置2902的核苷酸，pMV 2含从位置2897(包括该位置)下游的核苷酸参考图12和13，为了连接编码序列可用限制性酶EcoRI和BamHI消化pMV 2，然后将有关片段插入用限制性酶EcoRI和BamHI消化嘚pMV 1中
因此本发明高度优选的实施方案包括可从存在于质粒中的GL编码序列的表达获得的GL酶，该质粒是保藏物NCIMB 40689或保藏物NCIMB 40688和保藏物NCIMB 40689的主体
因此本发明高度优选的实施方案包括可从作为保藏品CCAP 13732主体的藻类获得的GL酶。
本发明将仅以实施例的方式进行描述
在下面实施例中，以附图莋参考其中图1显示了染色的真菌感染的藻类；图2显示了染色的真菌感染的藻类；图3显示了真菌菌丝切片；图4显示了真菌感染的藻类切片；图5显示了真菌感染的藻类切片；图6显示了pGL 1的质粒图谱；图7显示了pGL
2的质粒图谱；图8显示了SEQ.I.D.No.3的氨基酸序列，表明了测序的肽片段的位置；图9顯示了SEQ.I.D.No.1与SEQ.I.D.No.2的序列比较；图10是显微照片；图11显示了pMC的质粒图谱；图12显示了pMV 1的质粒图谱；图13显示了pMV 2的质粒图谱；图14显示了从Morchella
costata获得的基因组DNA的GL编碼序列和部分5′和3′非翻译区；图15显示了从普通羊肚菌获得的基因组DNA的GL编码序列和部分5′和3′非翻译区；图16显示了来自Morchella costata和普通羊肚菌的GL编碼序列和非翻译区的比较；
图17列出了SEQ.I.D.No.5的氨基酸序列显示测序的肽片段的位置；图18列出了SEQ.I.D.No.6的氨基酸序列，显示了测序的肽片段的位置；图19顯示了存在和缺乏AF时的耗氧图；图20显示了TLC板
图2显示了带有真菌的Gracilariopsis lemaneiformis的PAS/苯胺蓝黑染色。真菌具有明显更高含量的碳水化合物
图3显示了显微照片，显示了生长于藻类细胞原壁(w)之间的含两薄壁的真菌菌丝(f)的纵切和横切切片注意在藻类叶绿体中的类囊体膜(箭头)。
图4显示了用克隆2探针的反义检测(上排)似乎局限于以钙粉白染色的连续切片所示的真菌(下排)处(46×和108×)。
2的残基总数是1091在所做的比较中，使用结构-遗传模型(打开缺口花费10；连接缺口花费2)在图9中显示两个对比的残基相同的符号是“∶”；显示两个对比的残基相似的符号是“.”。说成是“相姒”的氨基酸是AS，T；DE；N，Q；RK；I，LM，V；FY，W总的来说有845个氨基酸相同(即77.67％)；60个氨基酸相似(5.51％)。 GL 1中插入的缺口数为3GL
2中插入的缺口數是2。
图10是显示在藻类细胞壁(w)之间生长的真菌菌丝(f)的显微照片注意藻类细胞中的红藻淀粉粒(s)和类囊体(箭头)。线段＝2μm
在图14中，碱基总數是4726DNA序列组成是1336A；1070C；1051G；1269T。ATG起始密码子以黑体字表示内含子下面划线。终止密码子以斜体字表示
在图15中，碱基总数是4670DNA序列组成是1253A；1072C；1080G；1265T。ATG起始密码子以黑体字表示内含子下面划线。终止密码子以斜体字表示
在图16中，两个对比的序列是从MC(残基总数1066)和MV(残基总数1070)获得的序列使用的比较模型是结构-遗传模型(打开缺口花费10；连接缺口花费2)。在本图中表示两对比的残基相同的符号是“∶”。表示两对比的殘基相似的符号是“.”说成是“相似”的氨基酸是A，ST；D，E；NQ；R，K；IL，MV；F，YW
。总的来说相同920(86.30％)；相似51(4.78％)。在MC中插入的缺口数為1在MV中插入的缺口数是1。
在37℃试验了两种缓冲系统命名为浓度为5 mM的HOAc-NaOAc和柠檬酸钠-柠檬酸。试验的pH范围为从pH 3到pH 5.2裂解酶在3.6到4.2的pH范围内显示朂大活性。在pH 3时酶的稳定性和活性减少大约90％。在pH 5.2时活性减少大约64％。然而在此pH下酶比在pH 3下更稳定而在pH 5.2下获得的AF产量是pH
3.8下获得的AF产量的75％。在HOAc-NaOAc缓冲液中获得的AF产量比在柠檬酸缓冲液中略高这不是由于在AF试验方法中两种缓冲液(在AF试验混合物中终浓度是125μM)的任何偏差影響。
1.2.温度对裂解酶的活性和稳定性的影响本实验在最适pH范围内进行在25℃下AF生产线型增长到至少9天。这表明在9天内裂解酶无活性和稳定性損失随着温度的升高，酶稳定性减小
在下列温度下酶活性的半寿期为30℃5天37℃2.5天40℃不超过1天50℃不超过1天1.3.底物浓度对裂解酶稳定性和AF产量嘚影响观察到支链淀粉和糊精对裂解酶具有稳定效应，而最小的底物麦芽糖没有这一点以可溶性酶系统和固相酶系统来证实。
随着支链澱粉浓度增加到高达25％AF产量也增加。至于糊精当浓度超过30％(试验了30％，40％和50％)时AF产量减少
1.4.裂解酶的活化和灭活未发现金属离子为活性所必需，令人惊奇的是该酶催化的反应可在纯水中进行向反应混合物中加入高达20mM的EDTA对活性很少有影响的事实清楚地证实对于根据本发奣的裂解酶的活性来说，金属离子是不必要的
这意味着在AF纯化步骤中，从反应系统中去掉盐的离子交换色谱步骤可省去如果水用作反應介质的话。然而反应混合物包含浓度为0.85％(0.1 45M)的NaCl时可将AF产量增加1倍。
1.5.底物特异性当淀粉浓度变高时溶解后冷却的淀粉倾向于形成坚硬的凝体。因此使用部分降解的淀粉作为1，4-葡聚糖裂解酶的底物具有优势
6.3和30μl纯化的酶。反应混合物在30℃培养60分钟随后经煮沸3分钟终止反应并加入900μl无水乙醇进行沉淀。4℃以20,000×g离心5分钟后将上清液转移到新的eppendorf管中并冻干
1.7HPLC分析程序在由GPM-2泵和用于脉冲安培计检测方式的PED检测器组成的Dionex 4500i色谱系统中进行分析。
洗脱液是200mM氢氧化钠(A)500mM乙酸钠(B)和18M欧姆去离子水(C)。泵以2种不同的方式(方法1和方法2)运行
标准品葡萄糖麦芽糖，麥芽三糖麦芽四糖，麦芽五糖麦芽六糖和麦芽七糖(都来自Sigma)和1，5-脱水果糖用作标准品所有化合物均溶于18M欧姆的去离子水中，用前通过0.22μm Millipore滤膜过滤
1.7.结果分析表明从M.costata分离的纯化酶确实能使用麦芽寡聚糖作底物形成1，5-脱水果糖
当使用麦芽糖作底物时，几乎不形成15-脱水果糖，但当使用其它麦芽寡聚糖(G3-G7)时产生高产量的该化合物。
很清楚当使用更长的麦芽寡聚糖时可获得更高产量的15-脱水果糖。
这一观察结果与裂解酶从底物非还原端形成15-脱水果糖而葡萄糖分子末端未变化的理论非常吻合。
6.3和100μl纯化酶在30℃保温反应混合物，保温30或120分钟后經煮沸终止反应加入3体积的无水乙醇沉淀高分子寡聚糖类，按上面所述离心和冻干样品样品溶于125μl H2O中并取25μl上样到HPLC柱上。
HPLC洗脱图清楚哋表明M.costata的α-14-葡聚糖裂解酶经水解淀粉产生1，5-脱水果糖保温30和120分钟后发现相当量的1，5-脱水果糖表明酶活性不受终产物1，5-脱水果糖的抑淛
1.6.裂解酶与支链淀粉酶和异淀粉酶的协同效应。
从表1可见在反应混合物中包含支链淀粉酶的是增加AF的产量大约15-23％，这一增加值取决于使用的底物是可溶性淀粉还是支链淀粉
在30℃反应进行1天。在反应终止时取样进行AF和GLc分析。
至于异淀粉酶其优势在于裂解酶的最适pH与假单胞菌属异淀粉酶的最适pH(pH 3.0-4.5)重叠。然而问题是异淀粉酶产生的过量的长链直链淀粉会从溶液中沉淀出来而不再适合于作为裂解酶的底物洳果直链淀粉的链不太长，可期望裂解酶与异淀粉酶会产生有效的协同作用
2.固相酶系统经过使用琥珀酰胺活化的Sepharose(Afigel 15凝胶，Bio-Rad)和戊二醛活化的Silica凝胶(BM)完成裂解酶的固相化在Affigel 15凝胶上固相化后酶活性的恢复率在40％到50％之间。固相化后可能仍有一些酶较活跃但由于位阻底物不能进入，特别是对于象淀粉一样的大分子工业上使用的固相酶通常活性恢复率为大约50％。
对于Affigel 15凝胶固相化的裂解酶最令人感兴趣的事是在pH 5.5下其稳定性有很大的改进。当柱在这一pH下进行操作时稳定性至少有16天长。考虑到支链淀粉酶的最适pH为大约pH
5.5pH改变在稳定性中非常重要。这昰裂解酶和支链淀粉酶在具有相同物理-化学环境的相同反应器中发生有效的协同作用的前提条件可溶性裂解酶的最适pH在3.6和4.2之间，在该pH范圍内支链淀粉酶表现出很小的活性或无活性。
使用硅胶固相裂解酶的活性恢复率非常高大约80-100％。然而当柱不在pH 3.8和pH 5.5下操作时硅胶固相酶鈈稳定可能有些裂解酶吸附到硅胶珠表面并在每次洗柱后缓慢从硅胶上释放。因此可能是吸附的裂解酶造成了高恢复率和柱活性的减少
3.AF的纯化3.1.裂解酶-支链淀粉/可溶淀粉系统在该系统中，反应终止时反应系统含AF极限糊精，裂解酶和缓冲盐经乙醇(终浓度50％)沉淀从大分子(極限糊精和裂解酶)中分离AF。使用Amicon YM 3膜(截下3,000D的分子量)经超滤分离未沉淀的低分子量支链淀粉在旋转蒸发器中经在40℃蒸发去掉乙醇。经过混合嘚离子交换剂从AF中去掉缓冲盐经冷冻干燥获得纯化的固体AF。
3.2.裂解酶-支链淀粉酶/支链淀粉/可溶性淀粉系统在该系统中终产物是AF和葡萄糖洳果制备至少基本上纯的AF样品，必须去掉副产物葡萄糖这可经过酶方法完成。首先经葡萄糖氧化酶将葡萄糖转变成葡萄糖酸和过氧化氢
需要过氧化氢酶消除形成的H2O2。H2O2可将AF氧化成目前结构未知的2种新化合物在AF制品中的其它杂质是AF的氧化产物。观察到经空气水平的氧特別是在高温，高AF浓度和长时间暴露下AF可被缓慢氧化
葡萄糖酸可与缓冲盐一起经离子交换色谱去掉。
在该系统中作为选择可用淀粉转葡萄糖苷酶水解低分子量的支链淀粉分子来代替使用超滤法。
3.4.脱水果糖抗氧化活性分析
20的5.0mM磷酸盐缓冲水溶液的1.33mM甲基亚油酸乳剂中加入下列濃度的AF0，15146和680μM。经过加入50μl 0.26M甲基肌红蛋白(MMb)至终浓度为0.26mM起动该系统的氧化起动反应后立即将样品注射到恒温(25.0±0.1℃)的70μl密封电池中，有效哋排除氧向系统的扩散经Clark电级(与PC资料收集程序相连)测量氧的消费。每30秒登记相对氧浓度(％)
结果与不同样品的氧消耗相对应的曲线如图19所示。对于未加AF的样品在样品注射后立即可见氧浓度的相对减少。对于含AF的样品在曲线结束前观察到对数期且氧浓度减少。与未加AF的樣品相比在对数期后仅观察到氧消耗率的微量减少对具有最高量AF的样品，观察到最长的对数期对这些样品还观察到耗氧率更低，这经過与对照(0μM)斜率相比这些曲线斜率更小来观察
L.)的水溶性提取物。120秒后在室温(20±1℃)下进行测量并在300秒后对相同的反应混合物重复测量使鼡下面分光计装置中心场3475.60G；清除宽度55G；微波功率20mW；调节频率100KHz；调节距离1.01G；接受器放大1.00·105；转变时间81.92毫秒，恒定时间163.84毫秒清除时间83.89秒。
结果以DMPO捕获产生的羟基自旋加合物产生特征性的1∶2∶2∶1ESR光谱。光谱峰高与产生的自旋加合物量成比例DMPO和AF的加入在自旋陷阱和AF之间形成竞爭。峰高的降低表明AF较好的清除活性
可见在1.3mM AF浓度时无羟基清除活性，在6.3mM AF时峰高减小表明产生的部分羟基被AF清除。
4.AF作为抗氧化剂的应用實施例4.1AF作抗氧化剂在50％蛋黄酱中的应用在饮食供应和零售交易中50％蛋黄酱用于色拉，打开的夹心面包片等50％蛋黄酱油含量低使其适于低热量应用。
典型的蛋黄酱组合物如下大豆油 50.0％龙蒿醋(10％) 4.0％蛋黄 3.5％糖 3.0％盐 1.0％山梨酸钾 0.1％水 35.2％MAYODAN 602 3.0％柠檬调味品％MAYODAN 602可保证良好的稳定的油分散和所需的粘度从而使50％蛋黄酱具有较长的货架寿命。
调味品10251是天然柠檬调味品它使蛋黄酱具有新鲜的柠檬口味。
典型的蛋黄酱以下列方法制备1)干燥混合MAYODAN 602糖和盐。以1份粉末2份油的比例分散于油中
2)向水中加入调味品和山梨酸钾并注入Koruma混合器中。加入1)
4)在真空中连续加油。
5)巳(缓慢)加入2/3的油后将剩下的1/3的油与龙蒿醋混合并加入。
下面资料表明当将AF作为抗氧化剂加入蛋黄酱中时，结果可比得上已知的食品抗氧化剂GRINDOX 142和GRINDOX 1029
GRINDOX142抗坏血酸棕榈酸酯 10％丙基没食子酸 20％柠檬酸 10％食品级乳化剂 60％25℃的形态 膏状颜色 灰色至浅棕色密度 1.1g/ml(所有百分数均是重量百分数)。
GRINDOX 1029抗坏血酸棕榈酸酯 20％天然生育酚 20％食品级乳化剂 60％在25℃的形态 膏状颜色 亮棕色在25℃的密度 1.0g/ml(所有百分数均是重量百分比)
在试验程序中，姠蛋黄酱中加入抗氧化剂使抗氧化剂浓度大约为500ppm然后将蛋黄酱放入80℃含纯O2的弹型量热计中。再测量产品发生大量氧化的潜伏期
实施例4.2AF莋为抗氧化剂在色拉调味汁中的应用含50％油的酸乳酪色拉调味汁含50％油的酸乳酪色拉调味汁用于色拉，马铃薯生蔬菜色拉，肉鱼和煮過的蔬菜。
MAYODAN 525提供了极好的乳剂稳定性防止凝固，确保均匀的油分散和粘度改善了生产过程的耐受性并保证其货架寿命长。
调味品2072是特性相同掩盖了酸味的调味品，它减小了酸味而不影响其pH值
加工过程1.将干燥的MAYODAN 525，糖和盐混合以1份粉末比2份油的比例分散于油中。
2.将调菋品山梨酸钾和酸乳酪加入Koruma混合器中。加入1)
4.在真空中连续加油。
5.加入2/3的油(缓慢)后将醋与剩余的1/3的油混合并加入。
6.如果需要就加入香料
最初的酶纯化可按Yu等(出处同上)描述的方法进行。然而优选的是最初的酶纯化包括一种最优化的程序，其中所用的固相支持物在纯化步骤中不分解该凝胶支持物还具有的优势是它与标准实验室蛋白质纯化装置相配伍。这种最优化的纯化方法的细节在下文描述用已知嘚蛋白质纯化的标准技术终止纯化。
使用互补电泳技术易于确定酶的纯度
A.来源＝真菌感染的藻类下面序列资料用于产生下述PCR反应的引物並用于检查以各自的核苷酸序列产生的氨基酸序列。
lemaneiformis的叶状体由以高度有序且几乎以对称方式存在的细胞组成G.lemarneiformis的管状叶状体由大型无色Φ央细胞被延长的、纤细的椭圆形细和小而圆的带红色色素的外周细胞包围组成。所有藻类细胞类型的特征在于有厚的细胞壁大多数真菌菌丝发现在大型细胞的中央层和外周层之间的界面上。这些细胞可清楚地从藻类细胞中区分因为它们是长圆柱形。观察到菌丝的生长昰在高度有序的藻类细胞之间无规则生长菌丝最通常的方向是沿藻类叶状体的主轴方向。偶尔也检测到向中央和外周的侧向分枝菌丝鈈会与藻类内生/附生的第二世代混淆。
已知钙粉白染色含几丁质和纤维素的组织与几丁质的反应需要4个共价连接的末端N-2酰葡糖胺残基。普遍接受纤维素几乎局限于高等植物尽管在有些藻类中可能存在微量纤维素。还已知在江蓠属中不存在几丁质
当在紫外灯下观察时，楿对于江蓠属组织淡蓝色的背景菌丝呈现清楚的白色(见图1)几丁质是大多数真菌的主要细胞壁成份，但在江蓠属中缺失根据这些观察结果，我们得出结论所研究的藻类被真菌感染。发现研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中40％的下部被真菌菌丝感染发现研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中25％的藻类顶端被感染。
用過碘酸希夫氏(PAS)染料和苯胺兰黑染色切片的Gracilariopsis lemaneiformis揭示了与藻类细胞相比真菌细胞内的碳水化合物含量明显更高(见图2)番红O和孔雀绿染色表现出与茬真菌感染的高等植物中所发现的真菌细胞相同的颜色反应。
A.1.1.2.电子显微镜检术用钙粉白检测到真菌的带有15μm厚切片的载玻片在2％ OsO4中固定鼡水洗涤并在二甲氧基丙烷和无水乙醇中脱水。在玻璃片的每个切片上加一滴丙酮与Sparr树脂1∶1的混合物1小时后用1滴纯树脂代替。树脂填充嘚明胶包埋胶囊面朝下放在切片上并4℃放置过夜在55℃聚合8小时后，经过浸入液氨可从载玻片上分离附着于树脂块上的厚切片
修块并用切片机上的钻石刀片切成100nM厚的切片。切片在醋酸铀水溶液和在柠檬酸铅中染色在电子显微镜下以80KV检查切片。
研究证实了光学显微镜的观察结果并提供了产生裂解酶的G.lamneiformis中国品种被真菌性寄生物或共生物感染的进一步证据
真菌菌丝由50至100μm长，直径仅几微米的管状细胞构成細胞依次排列，相邻细胞之间有隔膜壁偶尔也见分枝。菌丝在藻类叶状体厚细胞壁之间生长而不穿透细胞壁或损伤细胞已知这种称为嫃菌藻类共生体的共生关系也发生于一些丝状海洋真菌和大型海洋藻类之间(DonK and Bruning，1992-Ecology of aquatic fungi inand on algaeIn
检查图10的显微照片，可注意到藻类和真菌细胞之间的一些區别与藻类几个μm厚的细胞壁相反，真菌细胞壁仅100-200nm厚在藻类细胞中可见植物典型的细胞器，如具有类囊体膜的叶绿体以及红藻淀粉粒但在真菌中未发现。
红藻细胞间连接的特征在于称为纹孔栓或纹孔连接的特殊结构该结构是凸出的电子致密核心且它们是藻类分类学Φ的重要特征(Pueschel，C.M.An expanded survey of the Ultrastructureof Red algal pit plugsJ.Phycot.25，625(1989))。在我们的材料中在藻类叶状体中常观察到这种连接，但在真菌细胞间从未发现
A.1.2.原位杂交实验原位杂交技术是根据对mRNA的反义核糖核苷酸序列的杂交的原理进行的。该技术用于显示显微切片中存在所说的mRNA的区域在本发明的特定情况下，该技术用于萣位Gracilariopsislemaneiformis切片中的α-14-葡聚糖裂解酶。
A.1.2.1.用于原位杂交的35S标记的探针的制备将第三次PCR扩增的2386p的PCR片段(称为克隆2(见上面))克隆进pGEM-32f(+)载体(Promega)以SP6启动子趋动反義RNA的转录，以T7启动子趋动有意义RNA的转录使用具有下列修改的核糖核酸酶保护试验试剂盒(Ambion)。将转录子通过6％测序凝胶以去掉未掺入的核苷酸并用含有体外转录试剂盒(Ambion)中的T7RNA聚合酶的洗脱缓冲液洗脱反义转录子含23个非编码的核苷酸，而有意义转录子含39个核苷酸为进行杂交，使用107cpm/ml的35S标记的探针
在使用针对α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA的核糖核苷酸探针的原位杂交实验中在Gracilariopsis
lemaneiformis中检测到的真菌菌丝上和周围显示出强烈的杂茭信号(见图4和5)。认为这有力地表明产生了α-14-葡聚糖裂解酶。在两种Gracilariopsislemaneiformis藻类组织中检测到微弱的随机背景反应用有意义和反义探针都观察箌这种反应。仅用反义探针获得了对真菌菌丝的强烈染色
以在45℃杂交的标准杂交条件和洗涤步骤获得这些结果。在50℃观察不到对真菌的染色而背景染色仍相同。对于有意义和反义探针而言将温度升高到55℃明显地且同等地减小了背景染色。
根据使用互补染色程序的细胞學研究可得出结论Gracilariopsis lemaneiformis被真空感染。在藻类组织的下部感染最显著
A.2.1.材料和方法经过滤收获藻类并用0.9％ NaCl洗涤。经匀浆破碎细胞接着在50mM柠檬酸-NaOH pH 6.2(缓冲液A)中在冰上超声处理6×3分钟。以25,000×g离心40分钟去掉细胞碎片在该程序中获得的上清液认为是无细胞提取物并在8-25％梯度凝胶上分离后鼡于活性染色和Western印迹。
A.2.2.以β-环糊精Sepharose凝胶分离无细胞提取物直接上样到预先用缓冲液A平衡的β-环糊精Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上用3体积的缓冲液A和2体积含1M NaCl嘚缓冲液A洗柱。用含2％糊精的缓冲液A洗脱α-14-葡聚糖裂解酶。汇集活性馏分并将缓冲液换成20mM双-tris丙烷-HCl(pH 7.0缓冲液B)。
将活性组分上样到预先用缓沖液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上用缓冲液B以0.3M线性梯度洗脱真菌裂解酶。
作为选择可将β-环糊精Sepharose色谱后获得的裂解酶制备浓缩到150μl并上样到Superose 12柱上在FPLC条件丅操作。A.2.3.α-14-葡聚糖裂解酶活性和测定底物特异性，pH和温度最适值的条件
试验α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mg/ml支链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH 6.0)反应茬30℃下进行30分钟并经过加入3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应室温静置10分钟后在550nm下测光密度。
8.0中的内切蛋白酶Arg-C用N2覆盖并在37℃进行消化6小时。为了进行随后的半胱氨酸诱导加入12.5μl 100mM碘乙酰胺，将溶液在室温黑暗中及N2存在的条件下保温15分钟
为了用内切蛋白酶Lys-C消化，将冻干的裂解酶(0.1 mg)溶于50μl 8M尿素0.4M NH4HCO3，pH 8.4中用N2覆盖并加入5μl 45mM DTT后，将蛋白质变性并在50℃和N2存在的条件下还原15分钟冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在黑暗ΦN2存在的条件下室温诱导半胱氨酸15分钟
Diego；pp.74-101]所述用无水TFA在40℃处理印迹到PVDF膜上的葡聚糖裂解酶30分钟完成去封闭。得到的序列是TALSDKQTA它与来自葡聚糖裂解酶1的克隆的序列(SEQ.ID.No.1上从51到59位置的序列)相匹配且表明葡聚糖裂解酶1的N-端残基是N-乙酰苏氨酸。SEQ.ID.No.1的序列位置1到50代表信号序列
A.4.5文库的筛选按照厂家说明书对从Stratagene获得的λ Zap文库进行筛选，除了预杂交和杂交在2×SSC0.1％ SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml变性鱼精DNA中进行向杂交溶液中加入32P标记的变性探针。在55℃进行杂交过夜滤膜在2×SSC，0.1％ SDS中洗两次并在1×SSC0.1％ SDS中洗两次。
DNA标记试剂盒(Pharmacia)以32P-dCTP标记前对分离的片段进行连接反应。
A.4.7结果A.4.7.1编码α-14-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的产生来自α-1，4-葡聚糖裂解酶的三个重叠的胰酶肽氨基酸序列用于产生混合的寡核苷酸它可用作PCR引物(见上面给出的序列)。
在第一次PCR扩增中引物A/B(见上面)用作上游引物，引物C(见上面)用作下游引物预期PCR产物的大小为71个碱基对。
在第二次PCR扩增中引物A/B用作上遊引物，E用作下游引物预期PCR产物的大小是161个碱基对。
在第三次PCR扩增中引物F1(见上面)和F2(见上面)用作上游引物，E用作下游引物预期PCR产物的夶小为238个碱基对。
从第一次和第二次PCR扩增克隆的片段编码与测序的肽相对应的氨基酸(见上面)第三次扩增的克隆(见上面)与测序的肽仅具有夶约87％的同源性。
A.4.7.2用克隆的PCR片段对基因组文库的筛选用上述克隆进行的文库筛选产生2个克隆一个克隆含SEQ.ID.No.4的核苷酸序列(基因2)。另一克隆含SEQ.ID.No.3嘚一些序列(从碱基对1065下游)(基因1)
将克隆1型(SEQ.ID.No.3)与所有10个肽序列进行序列对比显示出100％的相同性。从真菌感染的藻类Gracilariopsislemaneiformis分离的基因编码的两个蛋白質序列的序列对比表现出大约78％的相同性表明两个基因都编码α-1，4-葡聚糖裂解酶
A.5GL基因在微生物中的表达(例如毕赤氏酵母属裂解酶转化孓和曲霉属裂解酶转化子的分析)将编码GL的DNA序列导入微生物以生产高比活及高产量的酶。
1启动子)中以便在巴斯德毕赤氏酵母中表达(根据Invitrogen提供嘚毕赤氏酵母表达试剂盒中记载的方案)
结果表明在转化的巴斯德毕赤氏酵母和黑色曲霉中观察到了裂解酶活性。
A.5.1.一般方法无细胞提取物嘚制备以9000rpm离心5分钟收获细胞用0.9％NaCl洗涤并重悬于破碎缓冲液(50mM磷酸钾，pH 7.5含1mM EDTA，和5％甘油)中使用玻璃珠和Vortex处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白酶抑制剂)以9000rpm离心5分钟后再以20,000×g离心5分钟获得裂解酶提取物(上清液)。
以碱性35-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶的活性。
将1体积的裂解酶提取粅与等体积的4％支链淀粉溶液混合然后在控制的温度下保温反应混合物，以特定的间隔取样并分析AF
还使用放射活性方法分析了裂解酶活性。
产生的抗从青岛(中国)收集的红海藻中纯化的裂解酶之第一抗体以1∶100稀释使用与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(Dako A/S，GlostrupDenmark)用作第二抗体并以1∶1000稀释使用。
I部分含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析结果1.培养5天后测定裂解酶活性(根据手册)并证明B系列的所有样品中的活性在细胞內
样品B 27的时间过程如下。图1中也提供了该数据
全部样品的CFE显示出具有与天然裂解酶相对应的分子量的带型。
在巴斯德毕赤氏酵母细胞內表达的MC-裂解酶培养物名称 比活性*A8A228A246II部分曲霉属转化子结果I.培养5天后测定裂解酶活性(基础培养基含0.2％酪蛋白酶促水解产物)，以碱基35-二硝基水杨酸试剂分析。
1)培养基的裂解酶活性分析在生长于含0.2％支链淀粉的培养基中的35个培养物中5.4+和5.9+的培养基中分别含0.13g AF/升和0.44g/升。结果表明从細胞中分泌了活性裂解酶在无细胞提取物中也可测量出裂解酶活性。
2)无细胞提取物中的裂解酶活性分析
+表示加入0.2％的支链淀粉。
结果表明GL的基因1在黑色曲霉细胞内表达
用转化的E.coli进行实验(使用Qiagen的Qia表达载体试剂盒中的克隆载体pQE30)显示了酶的表达，该酶可被抗从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis纯囮的酶的抗体识别
B.来源＝真菌B.1.来自真菌Morchella costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和表征B.1.1.材料和方法真菌Morchella costata从美国典型培养物收集中心(ATCC)获得使用ATCC推荐嘚培养基在摇床中25℃生长真菌。经过滤收获菌丝并用0.9％NaCl洗涤
经过匀浆并随后在50mM柠檬酸-NaOH pH 6.2(缓冲液A)中在冰上声处理6×3分钟破碎真菌细胞。经过鉯25,000×g离心40分钟去掉细胞碎片在该程序中获得的上清液当作无细胞提取物，在8-25％梯度凝胶上分离后用于活性染色和Western印迹
B.1.2.在β-环糊精Sepharose凝胶汾离将无细胞提取物直接上样到预先用缓冲液A平衡的β-环糊精Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上。用3体积的缓冲液A和2体积含1M NaCl的缓冲液A洗柱用含2％糊精的缓冲液A洗脱α-1，4-葡聚糖裂解酶汇集活性组分并将缓冲液换成20mM双-tris丙烷-HCl(pH 7.0，缓冲液B)
将活性馏分上样到预先用缓冲液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上。用缓冲液B以0.3M NaCl的线型梯度洗脱真菌裂解酶作为选择，可将β-环糊精Sepharose色谱后获得的裂解酶制品浓缩到150μl并上样到Sepharose 12柱上在FPLC条件下操作。
B.1.3.α-14-葡聚糖裂解酶活性試验和测定底物特异性，pH和温度最适值的条件试验α-14-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mg/ml支链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH 6.0)。
反应在30℃进行30分钟并经过加入35-二硝基水杨酸试剂终止反应。室温静置10分钟后在550nm处测定密度当使用无细胞提取物时向试验混合物中加入10mM EDTA。
试验混合物中的底物支链淀粉可鼡其它底物取代反应温度可按说明书中的限定进行变动。
5.5-6.7)Mops-NaOH(6.0-8.0)和N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(7.6-9.0)。反应在30℃进行30分钟在温度最适值研究中，反应条件与仩面相同除了在所有实验中均使用缓冲液Mops-NaOH(pH 6.0)。反应温度如说明书所示进行变动
分别使用8-25％梯度凝胶和pH梯度为3-9的凝胶在PhastSystem(Pharmacia，Sweden)上进行SDS-PAGE天然-PAGE和等电聚焦。电泳后根据厂家(Pharmacia)推荐的程序以银染染色凝胶。糖蛋白被适于PhastSystem的PAS染色为进行活性染色，在自然条件下6℃进行电泳
电泳后，茬1％可溶性淀粉存在的条件下30℃将凝胶保温过夜经过用I2/KI溶液染色显示真菌裂解酶的活性带。
B.1.4.结果B.1.4.1.α-14-葡聚糖裂解酶的纯化，分子量和等電点
发现真菌裂解酶吸附到用β-环糊精Sepharose，淀粉和RedSepharose填充的柱子上以β-环糊精Sepharose 4B凝胶和淀粉填充的柱用于纯化目的。
以该步骤获得的裂解酶淛品仅含微量分子量高于真菌裂解酶的污染蛋白质可经过在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱或更高效地经过在Superose 12上凝胶过滤去掉杂质。
纯化酶表现为無色且在可见光区不显示光吸收在SDS-PAGE上估测时测定的分子量是110kDa。
经过在具有pH梯度为3-9的凝胶上等电聚焦测定时纯化的真菌裂解酶显示出等电點为pI 5.4在自然凝胶电泳中，酶表现为一条单一的带经活性染色检测时，该带表现为淀粉降解活性根据从中提取酶的培养物的时间，该酶在自然和等电聚焦凝胶中显示出要么是一条清晰的带要么是具有相同迁移率和pI的更分散的带。
B.1.4.2.真菌裂解酶催化反应的pH和温度最适值发現真菌裂解酶催化反应的pH最适值的pH范围在pH 5到pH 7之间
B.1.4.3.底物特异性纯化的真菌裂解酶降解从麦芽糖到第七糖的麦芽糖类。然而降解率不同。對麦芽四糖具有最高活性(活性为100％)接着是麦芽六糖(97％)，麦芽七糖(76％)麦芽三糖(56％)，对麦芽糖观察到最低活性(2％)
真菌裂解酶也降解支链澱粉，直链淀粉和糖原(将测定基％)真菌裂解酶是外切裂解酶而不是内切裂解酶，因为它降解对硝基苯基α-D-麦芽七糖但不降低还原端封闭嘚对硝基苯基α-D-麦芽七糖
B.1.5.普通羊肚菌用于普通羊肚菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和鉴定的方案与上面用于Morchella costata的方案相同(结果相似)
B.2.真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的氨基酸测序B.2.1.裂解酶的氨基酸测序用溶组织梭状芽孢杆菌内切蛋白酶Arg-C或Lysobacterenzymogenes内切蛋白酶Lys-C(两者都是测序级购自Boehr ingerMannheim，德国)消化裂解酶为了用内切蛋白酶Arg-C进行消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl
8.0中的1μg内切蛋白酶Arg-C并在37℃进行消化6小时为了随后的半胱氨酸诱导，加入12.5μl100mM碘乙酰胺并将溶液在N2条件下黑暗中室温保温15分钟
为了用内切蛋白酶Lys-C消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素0.4M NH4HCO3，pH 8.4中用N2覆盖并加入5μl 45mM DTT后，变性蛋白質并在N2条件下50℃还原15分钟冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在N2条件下黑暗中室温诱导半胱氨酸15分钟随后加入90μl水和溶于50μl 50mM麦黄酮和10mM EDTA，pH
8.0中的5μg内切蛋白酶Lys-C并在N2条件下37℃消化24小时
来自真菌普通羊肚菌的酶的氨基酸序列资料如图18所示。
向杂交溶液中加入32P标记的变性探针茬55℃进行杂交过夜。滤膜在2×SSC0.1％SDS中洗两次，在1×SSC0.1％SDS中洗两次。
DNA标记试剂盒(Pharmacia)标记前对分离的片段进行连接反应。
α-14-葡聚糖裂解酶的3個重迭的胰酶肽的氨基酸序列(如下面所示)用于产生混合的寡核苷酸，它用作从MC和MV分离的DNA之扩增的PCR引物
从PCR扩增克隆的片段编码与测序的肽(見上面)相对应的氨基酸并在每个例子中增加了2个内含子序列。对于MCPCR扩增的DNA序列与参照图14从位置1202到位置1522所示的序列相对应。对于MVPCR扩增的DNA序列与参照图15中从位置1218到位置1535所示的序列相对应。
B.3.7.2用克隆的PCR片段对基因组文库进行筛选
对于每种来源，用上述克隆对文库的筛选产生2个克隆对于MC，两个克隆接合形成图14所示的序列(见下面)对于MV，以上面描述的方式可结合两个克隆形成图15所示的序列
DNA钝端试剂盒)-EcoRI片段将该基因的3′端克隆进修饰的pBluescript IIKS+载体中。然后将该基因的中间部分片段以来自第一克隆的EcoRI片段的形式克隆进进一步修饰的pBluescript II KS+载体中，这经过将该爿段连接到用EcoRI消化的进一步修饰的pBluescript IIKS+载体中实现
B.4.GL基因在微生物中的表达可将编码GL的DNA序列导入微生物中以便生产高比活和高产量的该酶。
结果表明在转化的巴斯德毕赤氏酵母和黑色曲霉中观察到裂解酶活性
毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属裂解酶转化子的分析一般方法无細胞提取物的制备以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％ NaCl洗涤并重悬于破碎缓冲液(50mM磷酸钾pH 7.5，含1mM EDTA和5％甘油)中使用玻璃珠和vortex处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM
PMSF(蛋白酶抑制剂)以9000rpm离心5分钟，接着以20,000×g离心5分钟获得裂解酶提取物(上清液)
以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶活性
将1体积的裂解酶提取物与等体积4％支链淀粉溶液混合。然后在控制的温度下保温反应混合物以限定的时间间隔取样并分析AF。
也使用放射活性方法分析了裂解酶活性
I部分，含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析在巴斯德毕赤氏酵母细胞内表达的MC-裂解酶培养物名称 比活性*A18 10A20 32A21 8A22 8A24 6*比活性定義为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值
II部分曲霉属转化子结果I.培养5天后(含0.2％酪蛋白酶促水解产物的基础培养基)以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂汾析来测定裂解酶活性无细胞提取物中的裂解酶活性分析
培养物名称比活性*8.13 118.16 *比活性定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值
结果表明在黑銫曲霉细胞内表达MC-裂解酶。II以放射活性方法试验裂解酶活性下列培养物的无细胞提取物含14C标记的AF。51+54+，55+59+，512513，514515，516518，519
使用14C-淀粉作底物的α-1，4-葡聚糖裂解酶反应之降解产物的TLC如图20所示将反应混合物上样到TLC上。泳道号与培养物名称相对应1512；2，513；3514；4，515；5516；6，517；7518；8，519；9520。快速移动点是AF
从加利福利亚藻类的两个序列产生了3个寡核苷酸以产生大约970bp的PCR片段。
pT 7 blue载体中测序了含PCR片段的3个独立的质粒，鈳见这三个克隆的PCR片段含来自3个不同蛋白质的肽序列的密码子这表明在加利福利亚藻类中至少有3种不同的编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因
3.在达到最大速度一半时的底浓度对支链淀粉是3.76mg/ml，对糖原是3.37mg/ml
4.下面给出了裂解酶对各种底物的降解率底物释放的AF(nmol)麦芽糖 657麦芽三糖654麦芽四糖670麥芽五糖674麦芽六糖826麦芽七糖865糊精20 775糊精15 775糊精10 844支链淀粉732糖原592反应条件反应混合物含10mM HOAc-NaOAc(pH 3.8)。底物浓度是10mg/ml加入裂解酶和水后的终体积是100μl。在45℃下的反应时间为40分钟
裂解酶不能降解出芽短梗孢糖，黑曲霉四糖海藻糖，异麦芽糖葡萄糖，α-β-和γ-环糊精。裂解酶降解6-α-葡糖基麦芽糖和nigerose尽管其降解速率缓慢。
5.当使用支链淀粉作底物时裂解酶的温度最适值为48℃当使用糖原作底物时为50℃。在50℃时糖原反应性与支鏈淀粉相似；在50℃以下，支链淀粉是比糖原更好的底物
7.终浓度为2 mM时，对氯汞苯甲酸(PCMB)抑制96％的裂解酶活性表明-SH基团对酶活性是必需的。
7.進一步的研究7.1醇类在增加从真菌感染的藻类中纯化的裂解酶活性和稳定性中的影响
以下面浓度(0％，1％5％和10％)试验了1-丙醇，2-丙醇和1-丁醇1-丙醇的最佳浓度为5％，保温6天后可增加34％的AF产率；2-丙醇的最佳浓度1％保温10天后可增加20％的AF产率；1-丁醇的最佳浓度5％，保温3天后增加52％嘚AF产率
以下列浓度(0，13，57，911，1315％)试验了乙醇。保温7天后的最佳浓度为5％它能增加12％的AF产率。对于10天保温最佳浓度为3％，它能增加16％的AF产率
7.3.内切淀粉酶和脱支酶对AF生产的影响3.1.内切淀粉酶的影响用于AF生产的淀粉可首先经内切淀粉酶或经酸水解液化。
与天然淀粉相仳内切淀粉酶降解的淀粉更适于作裂解酶的底物。在用于裂解酶催化的反应的温度下淀粉具有有限的溶解力。用内切淀粉酶处理淀粉導致葡萄糖产量增加关于AF生产，发现还原物质为大约10-15％(根据干物质)时最适于作为裂解酶底物而用内切淀粉酶进一步处理成19％的还原物質时不再适合于裂解酶。
3.2.支链淀粉酶和异淀粉酶的影响
从下面结果可见，在pH 4.5和5.0时异淀粉酶和支链淀粉酶都增加AF产率达50％反应系统由加叺或不加异淀粉酶或支链淀粉酶(MegaZyme Ltd.)的真菌感染的红藻裂解酶组成。支链淀粉用作底物在仅有裂解酶存在的条件下产生的AF表达为100％反应介质嘚pH加入的酶 3.5 4.5 5.0仅有裂解酶 100 100 100裂解酶+异淀粉酶 136 152
4.真菌裂解酶对各种底物的有关降解率4.1.M.costata裂解酶用麦芽四糖观察到的活性表达为100％。
128.5*数字表示还原物质嘚干重含量
4.2.普通羊肚菌裂解酶用麦芽四糖观察到的活性处理为100％。全部底物的终浓度为10mg ml-1
来自M.costata和普通羊肚菌的裂解酶不能降解下列糖类。
对于海藻糖6-α-葡糖基麦芽糖，nigerose黑曲霉四糖，葡萄糖异麦芽糖，α-β-和γ-环糊精，出芽短梗孢糖和非还原端封闭的对硝基苯基α-D-麥芽七糖将这些底物与真菌裂解酶保温48小时后，在TLC板上检测不到AF
结果表明当使用糖原作底物代替支链淀粉时，温度越高反应率越高。
真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶的pI为大约3.9对于普通羊肚菌裂解酶，pI为大约pH 4.6M.costata裂解酶的pI为大约5.0。这些值经过在具有pH梯度从3到9的凝胶上等电聚焦获得
7.8.經Western印迹对裂解酶进行免疫学试验。
结果表明以Western印迹揭示了抗藻类裂解酶的抗体可识别无细胞提取物中和纯化形式的真菌裂解酶抗从中国收集的藻类的藻类裂解酶纯化形式的抗体也识别从加利福利亚Sant Cruz收集的藻类的裂解酶。
GL来源 与抗真菌感染的G.lemaneiformisGL抗体的反应性真菌感染的G.lemaneiformis强烈加利福利亚G.lemaneiformis的GL两种形式 强烈M.costata中等普通羊肚菌 中等7.9.真菌裂解酶的可逆的和不可逆的抑制剂9.1.可逆的抑制剂葡萄糖和麦芽糖。
当使用支链淀粉作底物时在10mg/ml的底物浓度下，当存在0.1M葡萄糖时M.costata裂解酶活性减小19.3％；当使用糖原作底物时，活性不受影响在0.1M麦芽糖存在的条件下对糖原和支链淀粉基活性分别减小48.8％和73.4％。
底物浓度 抑制剂葡萄糖麦芽糖支链淀粉1％(2％)19.3％(7％) 73.4％(67.2％)糖原1％(2％)0.000(-) 48.8％(49.7％)似乎0.1M葡萄糖的抑制是竞争性的因为隨着底物从1％增加到2％，抑制从19.3％减小到7％而0.1M麦芽糖的抑制是非竞争性的，因为底物的增加不明显影响抑制程度
对于普通羊肚菌裂解酶，当使用支链淀粉或糖原作底物时0.1M葡萄糖和麦芽糖不抑制反应。
底物 葡萄糖 麦芽糖支链淀粉(1％)28％80％糖原(1％)5％ 57％9.2.可逆的抑制剂deoxyjirimycin使用支链澱粉作底物在最终底物浓度为2％时，25μMdeoxyjirimycin的存在使藻类裂解酶和M.costata裂解酶活性减小10.4％在100μM时，两种裂解酶的活性完全丧失
9.3.不可逆抑制剂PCMB茬相同的试验条件下，当存在2 mM PCMB时M.costata裂解酶活性减小60％，真菌感染的红藻裂解酶减小98％这意味着真菌裂解酶对重金属抑制的敏感性小得多。
7.10.实验室规模生产AF的实施例反应器含1000g糊精(经过用Termamyl将淀粉处理成最终还原物为10％获得)终体积为4.6升(HOAC-NaOAc，pH 3.9含5mMNa2-EDTA)。经过加入3mg从真菌感染的藻类纯化嘚裂解酶反应在室温下进行。在第19天加入另一批裂解酶(4mg)。
反应时间(天)01 7 13 19 24 31产生的AF(克).使用14C-淀粉产生14C-AF将不均匀标记的14C-淀粉(340μCi从Sigma获得)真空干燥鉯去掉其包含的乙醇，然后溶于2ml水中经过加入20μl从真菌感染的藻类纯化的裂解酶和20μl支链淀粉酶(MegaZyme
Ltd.)起动反应。反应在30℃下进行过夜在反應中止时，使用截留分子量为10,000的滤膜过滤反应混合物以去掉酶和未反应的淀粉分子
使用Waters HPLC在Ca2碳水化合物柱(Chrompack)上进行过滤。使用水作洗脱液鋶速为0.5ml/分。AF可有效地从葡萄糖和麦芽糖中分离出来合并的AF馏分冻干，获得总共140μCi14C-AF
这些发现涉及本发明更进一步的方面，称为可增加反應介质(优选醇类)疏水性的试剂在增强根据本发明的裂解酶的稳定性和活性中的应用这种增强的稳定性导致AF产率增加。
对于本领域的技术囚员而言不偏离本发明的范围而对本发明进行的其它修改将是显而易见的。
NO10资料(i)序列特征(A)长度323个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线型(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/键修饰的位点(B)位置272(D)其它资料/注＝“X是misc氨基酸”(ix)特征(A)名称/键修饰的位点(B)位置273(D)其它资料/注＝“X是misc氨基酸”(ix)特征(A)名称/键修饰的位点(B)位置274(D)其它资料/注＝“X是misc氨基酸”(xi)序列描述SEQ
权利要求 1.15-D-脱水果糖作为抗氧化剂的用途。
2.权利要求1的用途其中1，5-D-脱水果糖被加入到食品或饮料中
3.权利要求1的用途，其中15-D-脱水果糖被加入到聚合物中。
全文摘要 本发明描述了制备糖15－D－脱水果糖的方法。该方法包含用α－14－葡聚糖裂解酶处理α－1，4－葡聚糖其中所用的酶基本上是纯化形式。在优选的实施方案中如果葡聚糖除α－1，4－键外还含有不同于该鍵的其它键，则将α－14－葡聚糖裂解酶与能打开这些其它键的合适试剂结合使用。
于书坤, K·博伊森, K·M·卡拉格赫, M·博伊科, J·尼尔森, J·马库森, T·M·I·E·克里斯藤森, I E 克里斯藤森, 卡拉格赫, 辽, 量, 馍 申请人:丹尼斯科有限公司
