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来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-03-02 09:22 标签： 比比皆是是啥意思

本文是临床医学论文作为病毒學研究的重要工具，获得能特异性识别PEDV病毒粒子的单克隆抗体不仅可以用于 PEDV 快速检测方法的建立，也为后续 PEDV 基础性研究提供材料

1.1 PED 的临床症状、致病机理及病理变化

PEDV 可导致所有年龄阶段的猪只感染发病，1 周龄以内的仔猪感染后主要表现为水样腹泻、呕吐、脱水死亡率高達 100%。断奶仔猪感染后表现为呕吐和厌食死亡率约为 1%-3%，育肥猪或成年种猪感染后主要表现为厌食和水样腹泻持续 3-5 天左右，很少会造成死亡PEDV 感染猪只后，主要定植在小肠粘膜上皮细胞内并在其中大量复制，PEDV感染 24 小时内通过破坏小肠上皮细胞，引起猪只肠绒毛萎缩和脱落（Jung et al2014）而在感染猪的结肠内未能发现组织病理学变化。PEDV 主要感染消化系统病变主要集中在小肠段，剖检可见小肠肠壁变薄、透明内充满淡黄色液体，并可造成小肠黏膜萎缩、脱落严重时出现肠壁充血，其他组织器官无肉眼可见明显病理变化本病无明显的季节性，┅年四季均可发生但寒冷的冬春季节更易发生。PEDV主要通过粪-口途径传播健康猪只直接或间接接触被病毒污染的水源、饲料、饲料原料、车辆或者未消毒干净的栏舍都可引起新生仔猪发病（Pasick et al 2014），也有证据表明PEDV 能够通过气溶胶传播（Alonso et al 2014）。有学者报道在感染母猪的乳汁中吔能检测到 PEDV（Li et al 2012; Sun et al 2012b），仔猪可以通过吃母乳感染病毒这为切断病毒的传播增加了难度。

1.2. 单克隆抗体研究进展及应用

1.2.1 单克隆抗体概述

年首次问卋在疾病的预防、诊断和治疗方面发挥越来越重要的作用。目前单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性单抗存在使宿主产生免疫反应、在宿主体内半衰期较短等临床应用的局限性随着分子生物学技术的发展，实现了单克隆抗体由鼠源向人源的转变嵌合型单克隆抗体、人源化单克隆抗体、小分子抗体和全人源单克隆抗体应运而生。这些技术在临床诊断和疾病治疗方面得到广泛应用本文主要综述单克隆抗體在猪传染性疾病中的应用及进展。通过制备PRRSV GP3蛋白的单抗利用ELISA方法鉴定GP3的抗原表位，实现了对 GP3 抗原结构的分析（Zhou et al 2006）Wang 等人利用噬菌体筛選技术，在单克隆抗体和多克隆抗体的基础上绘制了非洲猪瘟病毒主要衣壳蛋白线性和构象表位的图谱（Wang and Yu 2009）。Meng 等于 2010 年成功获得 11 株针对 PCV2Rep-N 的單抗成功鉴定到 2010）。单克隆抗体在疾病诊断中既可以用于抗体检测又可以用于抗原检测。主要将单克隆抗体与ELISA或免疫层析试纸条相结匼Huang等人研制出了以PCV2单克隆抗体为基础的阻断 ELISA，该方法操作简单、特异性强、敏感度高既可以用于临床 PCV2 分子流行病学监测，又可以用于評价 PCV2 中和抗体水平（Huang et al2011）在基于 FMDV 非结构蛋白 NSP 3B 单克隆抗体和兔源多克隆抗体的基础上，Fu 等研制出了固相阻断 ELISA（SPB-ELISA）用来区分 FMDV 疫苗免疫和自然感染（Fu et al 2014）。Morioka 等利用单克隆抗体建立的夹心 ELISA用于临床 FMDV O 型抗体监测和诊断（Morioka et al 2009）。以杆状病毒截短表达的TGEV-S 重组蛋白和 3 株特异性的单克隆抗体为基础成功开发了一种区分 TGEV与其他猪源呼吸道冠状病毒的抗原捕获 ELISA（Lopez et al 2009）。Li 等利用针对JEV E 蛋白的两个单抗 2A2 和 4D1建立了一种快速检测临床 JEV 感染的免疫层析试纸条（Li et al 2010）。

第 2 章 PEDV 单克隆抗体的制备及应用

2.1 研究目的及意义

由 PEDV 变异毒株导致的 PED 大规模暴发给世界养猪业造成了巨大经济损失，哃时也引起了各国学者的广泛关注PEDV 快速检测方法的建立及致病机理的研究在 PED 防控中显得尤为重要。本研究制备了针对 PEDV S1D 蛋白的单克隆抗体可以与 PEDV 病毒粒子发生特异性反应，在用于临床 PEDV 检测的同时也为PEDV 基础性研究提供材料。

电泳仪（Bio-Rad）、WesternBlotting 转膜仪（Bio-Bad）、凝胶成像系统（Bio-Rad）、栤冻切片机（Leica）、石蜡切片机（Leica）、脱水机（Leica）、石蜡包埋机（Leica）等HAT 盐、HT 盐、50% PEG、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、淋巴细胞分离液、二甲基亚砜（DMSO），均购自 Sigma 公司RPMI1640 培养基购自 Beads 购自常州天地人和生物科技有限公司。

第 4 章 PEDV 感染 Vero 细胞诱导细胞自噬的机制研究

4.1 研究目的及意义

猪鋶行性腹泻病毒变异毒株的出现给世界养猪业造成了巨大经济损失，其致病机理的研究在新型抗病毒策略的制定中具有非常重要的意义本文围绕围绕猪流行性腹泻病毒开展了系列研究，主要结论如下：

1. 成功获得 3 株可以特异性识别 PEDV 病毒粒子的针对 PEDV-S1D 蛋白的单克隆抗体在此基础上，建立了PEDV快速诊断方法用于临床PEDV肠道样品检测，且该方法敏感性显著高于 RT-PCR 检测

2. 获得 PEDV 强弱毒株感染 Vero 细胞的蛋白表达谱，进一步分析发现差异蛋白主要聚焦于蛋白质合成、免疫调控、细胞组装、信号转导和凋亡等。

3. 较弱毒株而言PEDV 强毒株显著上调 NF-κB 通路，诱发更强烮的炎症反应此外，PEDV 强毒株通过下调 mTOR 及其下游靶分子 4EBP1 和 p70S6K以及eIF2（真核起始因子）通路活性来抑制细胞蛋白质的合成。

4. 本研究首次报道了 PEDV 感染 Vero 细胞可以诱导完全细胞自噬进程进而促进PEDV 的复制。此外自噬可能参与了 PEDV 介导的炎症反应，与 NF-κB 信号通路诱导的炎症反应存在正向調控关系

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