氨茶碱诱导T淋巴细胞自噬现象的观察_图文_百度文库
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氨茶碱诱导T淋巴细胞自噬现象的观察
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肿瘤源性热休克蛋白gp96诱导淋巴细胞反应及其抗肿瘤效应
摘 要：目的：研究肿瘤细胞来源的热休克蛋白gp96-多肽复合物在体外诱导脾淋巴细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应.方法：利用蛋白纯化技术、SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot法分离纯化
【题　名】肿瘤源性热休克蛋白gp96诱导淋巴细胞反应及其抗肿瘤效应
【作　者】朱昌来 林琳 张天一
【机　构】南通大学神经再生重点实验室,南通226001
【刊　名】中国免疫学杂志,
2007(3): 234-237
【关键词】gp96-肽复合物 H22细胞 细胞毒性T淋巴细胞 细胞凋亡
【文　摘】目的：研究肿瘤细胞来源的热休克蛋白gp96-多肽复合物在体外诱导脾淋巴细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应.方法：利用蛋白纯化技术、SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot法分离纯化、鉴定gp96-多肽;通过流式细胞术、免疫荧光技术、CCK-8法等检测经gp96多肽诱导的CD8^＋T细胞及其抗肿瘤效应.结果：经鉴定获得纯化的热休克蛋白;流式细胞仪检测表明,经gp96-肽复合物诱导后的CD8^＋T细胞比例达到近70%,远远高于对照组的35%、26%;该活化的CTL细胞在效靶比为50：1时的肿瘤杀伤率达72%,与对照组相比具有统计学意义;激光共聚焦显微镜观察证实实验诱导组的培养上清能诱导H22肿瘤细胞凋亡的形态学改变.结论：肿瘤来源的热休克蛋白gp96-肽复合物能诱导小鼠脾淋巴细胞的CTL反应,该活化的CTL具有特异性抗H22肿瘤细胞的免疫作用,并能分泌免疫活性物质诱导H22肿瘤细胞凋亡.
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gp96-肽复合物,H22细胞,细胞毒性T淋巴细胞,细胞凋亡
上一篇：暂无超抗原诱导人外周血T淋巴细胞的增殖--《军医进修学院学报》1996年02期
超抗原诱导人外周血T淋巴细胞的增殖
【摘要】：本文以人外周血淋巴细胞为材料，用超抗原葡萄球菌肠毒素Ｂ（ＳＥＢ）刺激后，检查了淋巴细胞的应答反应及特征。结果显示出微量的ＳＥＢ（１００ｎｇ）具有比ＰＨＡ、ＳＥＡ更为敏感的诱导Ｔ细胞应答反应的能力。Ｔ细胞应答反应中粘附性巨噬细胞起了抗原提呈作用；去除了粘附细胞，Ｔ细胞表现出完全不反应。Ｔ细胞活化途中伴随白介素２（ＩＬ－２）的释放。荧光染色的结果证明ＳＥＢ诱导了外周血Ｔ细胞的增殖，这些细胞是识别ＭＨＣＩＩ类抗原的Ｔ细胞；它们由最初的２７％增加到４１％。并显示出由外周血群细胞分化而来。提示外周血细胞的大量增殖可能与外周血Ｔ细胞分化有关。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R392.11【正文快照】：
超抗原诱导人外周血Ｔ淋巴细胞的增殖陈钰，张云林，刘颖，刘成贵摘要本文以人外周血淋巴细胞为材料，用超抗原葡萄球菌肠毒素Ｂ（ＳＥＢ）刺激后，检查了淋巴细胞的应答反应及特征。结果显示出微量的ＳＥＢ（１００ｎｇ）具有比ＰＨＡ、ＳＥＡ更为敏感的诱导Ｔ细胞应答反应
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T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面涪饥帝渴郜韭佃血顶摩抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。
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枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响
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何彦丽，应逸，许艳丽，苏俊芳，罗惠，王惠峰
11:45:48 《中西医结合学报》 2005年10月 第3卷 第5期
关键词：枸杞多糖
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P&0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
〔关键词〕枸杞多糖; 免疫抑制; 淋巴细胞亚群; 肿瘤浸润淋巴细胞; 树突状细胞
Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice
HE YanLi, YING Yi, XU YanLi, SU JunFang, LUO Hui, WANG HuiFeng
(Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, C Department of Hematology, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)
Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P&0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
Lycium bar T tumorinf dendritic cells
近年来的研究发现：肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制，表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型异常，这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因〔1,2〕。已有研究证实：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明显的免疫调节和免疫保护功能，可以增强机体的抗肿瘤作用〔3,4〕。但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何？是否与其影响免疫活性细胞的功能有关？如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制？有关这方面的研究却鲜见报道。本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型，研究LBP在全身给药情况下，对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响，从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。
1材料与方法
昆明种小鼠，清洁级，6～8周龄，体质量（18±2）g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，动物质量合格证号0002769；H22肝癌腹水型细胞株，中山大学医学院动物中心细胞库提供；LBP，由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取，呈棕黄色粉末，纯度≥35%；Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的抗小鼠CD4、CD80（B71）单克隆抗体，藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日本岛津公司产品；FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。
1.2实验动物及分组
昆明种小鼠60只，随机分成4组：正常组、模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组，每组15只。其中后3个组，第1天右侧腋下接种2×106个H22肿瘤细胞。第3天起，前2个组小鼠予以生理盐水灌胃，0.5 ml/d；后2个组LBP给药剂量根据文献〔5〕结合预试验结果，分别给予LBP 0.625 g?kg1?d1及1.25 g?kg1?d1灌胃（均用生理盐水稀释成0.5 ml/d），连续灌胃14 d。
1.3LBP体内抑瘤率的测定 每日观察并记录小鼠生长情况及肿瘤大小，第15天小鼠眼球放血后予以脱颈处死，解剖并观察肿瘤大小及重量，计算肿瘤生长抑制率：局部肿瘤的生长抑制率=（模型组平均瘤重－LBP组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。所有动物均摘取胸腺称重，计算胸腺指数（胸腺指数＝小鼠胸腺质量/体质量）。
1.4肿瘤间质淋巴细胞的分离
肿瘤组织称重后，挑选瘤体质量≥2 g者置于含青霉素和链霉素各500 U/ml、甲硝唑5 μg/ml的RPMI1640培养液中浸泡30 min后，将瘤体剪成1 mm3大小，置于含0.05% Ⅳ型胶原酶、0.003% Ⅰ型DNase酶及10%小牛血清的RPMI1640培养液中，4 ℃磁力搅拌过夜消化，200目消毒铜网过滤洗涤后，1 500 r/min离心15 min，分离获得肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL），用DHanks液洗涤2次，台盼蓝染色检测细胞活力，调整细胞浓度至1×106/ml。
1.5TIL中CD4、CD8a、CD11c、CD80流式细胞仪分析
每个样本分3管，每管中加入3×105个细胞，PBS液调整总体积为100 μl，其中第1管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD4、CD8a单克隆抗体0.5 μl（0.25 μg）、1.0 μl（0.2 μg），第2管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD11c、CD80单克隆抗体1.0 μl（0.2 μg）、1.0 μl（0.5 μg），第3管为空白对照管，室温避光孵育30 min，PBS液洗涤2次，每次实验取2管细胞分别加入FITC和PE单荧光素标记抗体，用流式细胞仪检测。
1.6统计学方法
所有实验数据均采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，行单因素方差分析及组间比较最小显著差(least significant difference, LSD)法。
2.1LBP对H22荷瘤小鼠肿瘤生长及胸腺指数的影响
模型组平均瘤体质量（2.48±0.40）g，LBP低剂量组和高剂量组分别为（1.89±0.29）g和（1.46±0.26）g，其中，LBP高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P&0.05）。LBP低剂量组和高剂量组的肿瘤生长抑制率分别为23.79%和41.12%。模型组荷瘤小鼠的胸腺质量较正常组轻，LBP组荷瘤小鼠的胸腺质量及胸腺指数则有所恢复。见表1。
LBP对H22荷瘤小鼠胸腺指数的影响（略）
Effect of LBP on thymus index in H22bearing mice
*P&0.05, vs model control group
2.2LBP对H22荷瘤小鼠TIL中T淋巴细胞亚群的影响
模型组肿瘤间质浸润CD4+、CD8+ T淋巴细胞的百分比分别为（12.89±1.05）%和（7.72±0.48）%。LBP组CD4+和CD8+细胞的百分比较模型组均有明显升高，其中LBP低剂量组CD8+与模型组比较差异有统计学意义（P&0.05），LBP高剂量组CD4+、CD8+与模型组比较差异均有统计学意义（P&0.05）。见表2。
2.3LBP对H22荷瘤小鼠TIL中DCs的影响
模型组TIL中CD11c+百分比为（23.07±2.36）%，CD80+为（15.15±1.47）%，双阳性细胞仅为（11.65±1.73）%；LBP组CD11c+、CD80+及双阳性细胞的百分比较模型组均略有升高，与CD4+、CD8+细胞百分比的升高变化有一定的平行关系，但模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组这三者之间的比较差异无统计学意义。见表2。
LBP对H22荷瘤小鼠TIL中T淋巴细胞亚群及DCs的影响（略）
Effect of LBP on Tlymphocyte subsets and phenotypes of dendritic cells in TIL
*P&0.05, vs model control group
已有研究证实：LBP具有广泛的免疫调节作用，可以增强机体的抗肿瘤效应〔3,4〕。本实验发现：LBP能明显抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长，与文献报道一致，LBP高剂量组肿瘤生长抑制率为41.12%，与模型组比较差异有统计学意义（P&0.05）；LBP还可提高荷瘤小鼠的胸腺质量及胸腺指数，对胸腺具有一定的保护作用。
机体的抗肿瘤免疫主要依靠T淋巴细胞介导的细胞免疫。成熟的T淋巴细胞分为CD4+和CD8+ T淋巴细胞两个亚群。一般认为：CD4+ T淋巴细胞产生大量的细胞因子，CD8+ T淋巴细胞在CD4+ T淋巴细胞的辅助及细胞因子的作用下可以杀伤肿瘤细胞，初次的抗肿瘤免疫反应主要依赖CD8+ T淋巴细胞和自然杀伤细胞的参与。肿瘤特异性的CD4+ T淋巴细胞对肿瘤细胞也具有直接的杀伤作用〔6〕。缺乏CD4+和CD8+ T淋巴细胞，以及CD4+/CD8+比值的降低是导致抗肿瘤免疫效应低下的原因之一。一些研究还发现：LBP是一种有效的免疫增强剂，对免疫系统具有正向的调节作用。刘彦平等〔7〕用BALB/c小鼠做体内研究发现：LBP能增加小鼠脾脏总的T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞（helper T cell, Th）及抑制性T淋巴细胞（suppressor T cell, Ts）的数量，使Th和Ts亚群的比例恢复正常。有研究报道：食管癌组织中的TIL经白细胞介素2、白细胞介素4联合中药黄芪、干地黄水提取物行体外诱导后，CD3+、CD4+细胞比例及CD4+/CD8+的比值均明显上升〔8〕。本实验通过流式细胞术检测发现：模型组TIL中的T淋巴细胞数量明显减少，表明肿瘤微环境中T淋巴细胞的抗肿瘤免疫活力低下，而LBP组的CD4+、CD8+ T淋巴细胞则恢复明显，CD4+在LBP高剂量组，CD8+在LBP低、高剂量组与模型组之间的比较差异均有统计学意义，说明LBP可促进TIL中CD4+、CD8+ T淋巴细胞的增殖与活化，直接杀伤肿瘤细胞，或通过其分泌的细胞因子辅助杀伤肿瘤细胞，一定程度地解除荷瘤机体的免疫抑制状态，从而产生抗肿瘤的效应。
DCs是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，在抗肿瘤免疫应答中起着不可替代的作用，多数证据表明，荷瘤机体免疫机制的失能不是由于缺乏肿瘤抗原，而是由于DCs的功能缺陷导致这些抗原不能被有效地提呈给T淋巴细胞，从而不能诱导细胞毒性T淋巴细胞产生有效而特异性的免疫应答。有多种原因可导致荷瘤机体DCs表型的改变，是引起抗肿瘤免疫功能减弱的直接原因。Chaux等〔9〕研究发现：癌旁组织浸润的炎性细胞中主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原分子高表达，而其B71（CD80）和B72（CD86）等共刺激分子则无表达或低表达；丘少鹏等〔10〕对前列腺癌肿瘤微环境中DCs细胞与T淋巴细胞之间免疫关系的研究发现：肿瘤间质中DCs占（20.89±6.06）%，明显低于癌旁组织中的（43.11±6.13）%，且与T淋巴细胞的分布显著相关，故认为癌组织中DCs数量的减少可能与前列腺癌肿瘤微环境T淋巴细胞抗肿瘤的免疫功能低下有关。LBP在体内外可促进多种细胞因子的分泌〔11〕，如白细胞介素2、白细胞介素3、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子等，这些因子均能刺激DCs增殖及表型成熟〔12〕。CD11c强烈表达于DCs，通常采用B71、B72分子及主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原分子等单克隆抗体检测DCs细胞表型及成熟程度〔13,14〕。本实验发现：模型组肿瘤间质中浸润的单个核细胞CD11c+的百分比为（23.07±2.36）%、CD80+为（15.15±1.47）%，而双阳性细胞只占（11.65±1.73）%，说明成熟、有功能的DCs细胞数量较低；LBP低、高剂量组CD11c+、CD80+及双阳性细胞的百分比均有所上升，与T淋巴细胞亚群的变化有一定的平行关系，但各组间的比较无统计学意义。本实验还发现：LBP可以增加肿瘤间质中CD4+、CD8+ T淋巴细胞的数量，LBP是否可通过使DCs前体细胞增殖并诱导分化为成熟的DCs而使其具有正常的抗原提呈能力，进而激活T淋巴细胞，从而发挥抗肿瘤的作用？上述问题值得进一步研究。
因流式细胞仪的检测有一定的细胞数量要求，细胞数低于105以下时数据的准确性下降，而肿瘤间质中淋巴细胞的分离操作步骤繁琐，又有多次的洗涤过程，因此可能造成较多细胞的损伤与丢失，当肿瘤组织块太小时，更容易导致检测失败，所以只将肿瘤重量≥2 g者纳入检测范围，但这样就造成肿瘤体积明显减少的一部分LBP组的样本未纳入检测范围，从而可能导致结果的偏差。而LBP的抗肿瘤作用是否与其增加DCs的数量及促进其成熟有关，尚待进一步的研究。
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14程晓明, 王长征, 李淑平, 等. 小鼠脾脏树突状细胞的分离培养及鉴定〔J〕. 第三军医大学学报, ): .
〔本文编辑〕黄文华
〔基金项目〕广东省中医药管理局资助项目（No. 101054）
（广州中医药大学病理学教研室，广东 广州 510405; 广州市第一人民医院血液科，广东 广州 510180）
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