DGT的制备、性能测试及在海水分析中的应用--《厦门大学》2014年硕士论文
DGT的制备、性能测试及在海水分析中的应用
【摘要】：重金属在海水中以各种化学形态存在。研究表明与生物体直接作用的并不是总溶解态金属,而是溶解态金属中的一部分,这部分被定义为活性(labile)金属。海水中重金属的存在形态是研究其毒性和生物可利用性的关键参数。
目前研究海水中重金属的形态,一般需将样品采集回实验室后进行分析。但水样中重金属的化学形态容易在样品采集、运输、预处理与保存过程中发生转化,且各种试剂的添加也会对重金属的化学形态分布造成影响,因此原位富集技术的开发应用是十分必要的。
薄膜扩散梯度技术(Diffusive Gradients in Thin-films Technique, DGT)是1994年提出的一种原位富集有效态重金属的新技术。DGT采样装置的关键部件包括扩散相和结合相；水体中的重金属通过扩散相进入结合相而被富集,富集量与时间有关而与样品体积无关。
本研究制作了三种结合相。一是广泛采用的Chelex-100树脂凝胶,二是戊二醛改性壳聚糖膜,三是戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜。采用改性琼脂糖交联的聚丙烯酰胺凝胶作为扩散相。自制DGT采样装置,对其进行性能测试,并应用于海水中有效态重金属的原位富集。主要研究内容及结果如下：
(1)使用改性琼脂糖交联的聚丙烯酰胺凝胶作为扩散相,并在凝胶中嵌入Chelex-100树脂作为结合相。应用该DGT采样装置同时原位富集海水中的锰、钴、镍、铜、锌、镉、铅。使用自制的凝胶扩散系数测定装置测定了金属离子在该扩散相中的扩散系数。考察了pH、高盐基底等对富集效果的影响。pH在5.6-8.6,离子强度在10～700mmol·L-1范围内,富集效果良好。在厦门近岸海域成功地进行为期7d的海水中重金属的原位富集实验,结果显示,DGT能够富集该海域海水中溶解态重金属的6.67%～45.33%,即获得DGT有效态。平行样测定的RSD均小于10%。本方法能准确原位地富集海水中的生物有效态重金属,具有原位、便捷、pH适用范围广、在河口和近海富集时基本不受离子强度影响及样品存放时间长等优点,为海水中痕量有效态重金属的分析提供了有效的采样技术。
(2)在上述工作基础上建立了以改性琼脂糖交联的聚丙烯酰胺凝胶为扩散相、以戊二醛改性壳聚糖膜为结合相的DGT采样装置。应用该装置同时富集加标海水中的钴、镍、铜、锌、镉。考察了戊二醛改性壳聚糖对不同浓度重金属的吸附效率,结果显示,在相同重金属浓度下,戊二醛改性壳聚糖膜的吸附效率高于Chelex-100树脂。考察了pH、高盐基底等对富集效果的影响。结果显示,pH在5-8范围内富集效果基本不受影响。离子强度为10和700mmol·L-1时,富集效果差别不大,说明该方法适用于河口及近岸海水中痕量重金属的分析。在实验室内成功地进行为期3d的加标海水中重金属的原位富集实验,结果显示,DGT能够富集海水中溶解态重金属的12.57%-64.68%。平行样测定的RSD均小于10%。与Chelex-100为结合相的DGT富集效果比较无显著差异,但戊二醛改性壳聚糖膜的制备过程较Chelex-100树脂凝胶的制备过程更简易。
(3)在上述工作基础上,建立了以改性琼脂糖交联的聚丙烯酰胺凝胶为扩散相、以戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜为结合相的DGT采样装置。应用该装置同时富集加标海水中的钻、镍、铜、锌、镉。实验结果显示,在相同浓度的重金属溶液中,戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜吸附效率高于Chelex-100树脂及戊二醛改性壳聚糖膜。pH在5-8范围内富集效果基本不变。测定离子强度分别为10和700mmol·L-1时DGT的富集效果,结果显示两种离子强度下富集效果无明显差异,说明该方法适用于海水中痕量重金属的分析。采用该DGT采样装置,持续3d采集加标海水中的重金属,获知该海水样品中DGT有效态重金属为溶解态重金属的26.06%～87.25%,平行样的RSD均小于10%。相同实验条件下,以戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜为结合相的DGT装置所富集的有效态比例,高于以Chelex-100树脂凝胶及戊二醛改性壳聚糖膜为结合相的DGT。
【关键词】：
【学位授予单位】：厦门大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：O636.1;P734.4【目录】：
目录4-9Table of Contents9-14摘要14-16ABSTRACT16-19常用缩略语表19-20第1章 绪论20-36 1.1 重金属概况20-23
1.1.1 海洋中重金属的来源20-21
1.1.2 海洋中重金属的性质与危害21-23 1.2 海洋中重金属的研究23-24
1.2.1 海洋中重金属的分布23-24
1.2.2 海洋中重金属的形态24 1.3 海洋中重金属的形态分析方法24-28
1.3.1 阳极溶出伏安法25
1.3.2 差分脉冲阳极溶出伏安法25-26
1.3.3 阴极溶出伏安法26-27
1.3.4 离子选择电极法27-28 1.4 海洋中重金属的预富集和除基底方法28-33
1.4.1 离子交换法28
1.4.2 粒径分级法28-29
1.4.3 薄膜扩散梯度技术法29-33
1.4.3.1 DGT装置的构造与组成29-30
1.4.3.2 扩散相30
1.4.3.3 结合相30-31
1.4.3.4 DGT的富集原理31-32
1.4.3.5 DGT的应用32-33 1.5 本课题的提出及研究内容33-36
1.5.1 课题的提出33-34
1.5.2 研究内容和技术路线34-36第2章 以聚丙烯酰胺凝胶为扩散相及Chelex-100为结合相的DGT富集方法的建立和应用36-58 2.1 前言36 2.2 实验部分36-45
2.2.1 仪器与试剂36-37
2.2.2 试剂和器皿的净化处理37-38
2.2.2.1 器皿的清洗37
2.2.2.2 凝胶制备液的配制及纯化37
2.2.2.3 测定扩散系数的使用液的配制37
2.2.2.4 Chelex-100树脂的净化37-38
2.2.2.5 滤膜的预处理38
2.2.3 DGT凝胶的制备38-39
2.2.3.1 扩散相凝胶的制备38-39
2.2.3.2 结合相凝胶的制备39
2.2.4 各金属离子在扩散相凝胶内扩散系数的测定39-41
2.2.4.1 凝胶扩散系数测定装置及使用39-40
2.2.4.2 各金属离子扩散系数的计算40-41
2.2.5 Chelex-100树脂对重金属的吸附率41
2.2.6 重金属从Chelex-100树脂上洗脱的效率41
2.2.7 DGT采样装置的组装41-42
2.2.8 DGT性能的测试42-43
2.2.8.1 方法空白样的制备42
2.2.8.2 pH影响的测试42
2.2.8.3 离子强度影响的测试42-43
2.2.9 DGT采样富集43
2.2.9.1 实验室内海水中重金属的富集43
2.2.9.2 海域水中重金属的富集43
2.2.10 DGT所采样品的预处理43
2.2.11 样品分析43-44
2.2.12 水体中待测金属离子浓度的计算44-45 2.3 结果与讨论45-57
2.3.1 各重金属离子工作曲线45-46
2.3.2 NaOH纯化及Chelex-100树脂净化的结果46-47
2.3.3 重金属在扩散相凝胶中的扩散系数47-50
2.3.4 Chelex-100树脂对重金属的吸附率和重金属从Chelex-100树脂上的洗脱率50-51
2.3.5 方法空白51-52
2.3.6 试样pH和离子强度对重金属回收率的影响52-55
2.3.6.1 pH的影响52-53
2.3.6.2 离子强度的影响53-55
2.3.7 本方法的实验室应用55
2.3.8 本方法的海域现场应用55-57 2.4 本章小结57-58第3章 以戊二醛改性壳聚糖膜为结合相的DGT富集方法的建立58-70 3.1 前言58 3.2 实验部分58-62
3.2.1 仪器与试剂58-59
3.2.2 DGT扩散相凝胶及戊二醛改性壳聚糖膜的制备59-60
3.2.3 戊二醛改性壳聚糖膜的净化60
3.2.4 戊二醛改性壳聚糖膜的红外光谱表征60
3.2.5 戊二醛改性壳聚糖膜对重金属的吸附率60-61
3.2.6 金属从戊二醛改性壳聚糖膜上洗脱的效率61
3.2.7 试样pH对戊二醛改性壳聚糖吸附效率的影响61
3.2.8 离子强度为0.7 mol·L~(-1)时戊三醛改性壳聚糖膜对重金属的吸附率61-62
3.2.9 DGT采样装置的组装62
3.2.10 DGT采样及方法空白样的制备62
3.2.11 加标海水样品中重金属的富集62
3.2.12 DGT所采样品的预处理及分析62 3.3 结果与讨论62-69
3.3.1 戊二醛改性壳聚糖膜的净化结果62-63
3.3.2 戊二醛改性壳聚糖膜的红外表征63-64
3.3.3 戊二醛改性壳聚糖膜对重金属吸附率64
3.3.4 重金属从戊二醛改性壳聚糖膜上洗脱的效率64-65
3.3.5 试样pH对戊二醛改性壳聚糖吸附效果的影响65-66
3.3.6 离子强度为0.7 mol·L(-1)时戊二醛改性壳聚糖膜对重金属的吸附率66-67
3.3.7 方法空白67-68
3.3.8 加标海水样品中重金属的DGT富集效果68-69 3.4 本章小结69-70第4章 以戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜为结合相的DGT富集方法的建立70-80 4.1 前言70 4.2 实验部分70-73
4.2.1 仪器与试剂70
4.2.2 DGT扩散相凝胶戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜的制备70-71
4.2.3 戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜的净化71-72
4.2.4 戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜的红外光谱表征72
4.2.5 戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜对重金属吸附的效率72
4.2.6 重金属从戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜上洗脱的效率72
4.2.7 试样pH对戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖吸附效率的影响72
4.2.8 离子强度为0.7 mol·L~(-1)时戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖对重金属的吸附率72
4.2.9 DGT采样装置的组装72
4.2.10 DGT采样及方法空白样的制备72
4.2.11 加标海水样品中重金属的富集72-73
4.2.12 DGT所采样品的预处理及分析73 4.3 结果与讨论73-79
4.3.1 戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜的净化结果73
4.3.2 戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜的红外表征73-74
4.3.3 戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜对重金属吸附率74-75
4.3.4 重金属从戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖膜上洗脱的效率75-76
4.3.5 试样pH对戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖吸附效果的影响76
4.3.6 离子强度为0.7 mol·L~(-1)时戊二醛-L-半胱氨酸-壳聚糖对重金属的吸附率76-77
4.3.7 方法空白77-78
4.3.8 加标海水样品中重金属的DGT富集效果78-79 4.4 本章小结79-80第5章 结语与展望80-82 5.1 研究总结80 5.2 本研究的不足与展望80-82参考文献82-95攻读硕士学位期间发表的论文95-96致谢96
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上山采靡芜，下山逢故夫。长跪问故夫：“新人复何如？”“新人虽言好，未若故人姝。颜色类相似，手爪不相如。新人从门入，故人从阖去。新人工织缣，故人工织素。织缣日一匹，织素五丈余。将缣来比素，新人不如故。
翩翩堂前燕，冬藏夏来见。兄弟两三人，流宕在他县。故衣谁当补？新衣谁当绽？赖得贤主人，览取为吾?。夫婿从门来，斜柯西北眄。语卿且勿眄，水清石自见。石见何累，远行不如归。
与生动通俗的语言风格相联系，汉乐府在修辞手法方面有几个明显的特点：（一）较多运用问答体。《东门行》、《妇病行》、《艳歌何尝行》、《焦仲卿妻》、《陌上桑》、《上山采蘼芜》、等名篇无不如此。问答形式避免了文体呆板枯燥，增进了语言的活泼灵动；这些诗篇的人物（《艳歌何尝行》里的双白鹄其实是以幻化形式出现的夫妻）话语一般能达到口吻毕肖，对塑造生动的人物形象起了重要的作用。此外，问答的特点主要是诉之于听觉感官，更要求浅显易懂，这在无形中对文辞化的倾向作了限制。《焦仲卿妻》和《陌上桑》虽有较多文采，但是其中的人物对话部分（在全诗占不小的比例）基本上是浅近的口语，它们无疑是提高这些诗通俗化程度的重要因素。（二）以直陈为主，适当运用比兴和夸张。赋、比、兴是后人对《诗经》艺术经验的总结，《诗经?国风》运用比兴之体较多，汉乐府则以赋体为主。以浅近的语词直接陈诉事理，这是汉乐府区别于《诗经》的一个显着特点。一般来说，直陈之语比较容易写得通俗，而大量应用比兴，不免会有“意深”难通之患。当然，汉乐府也有少数使用比兴的地方。“比”的例子如《白头吟》“皑如山上雪，皎若云间月”，白雪、明月喻示纯洁的爱情；同诗：“躞碟御沟上，沟水东西流”，以东西流走的沟水比况两人结束情侣关系，各自离去。又如《艳歌可尝行》通篇作拟人描写，是比的范围的扩大。“兴”的例子如《艳歌行》“翩翩堂前燕，冬藏夏来见”，这二语兴起全篇描述流宕者飘忽不定、奔波劳碌的生活；《焦仲卿妻》也以“孔雀东南飞”起兴，作为主题的象征。这些对增加作品的生动性和丰富作品的蕴意都起了很好的作用。由于这类被用来作比兴的事物本身的特征性很强，容易为人辨识；加上比兴的出现率比较低，因此它们并没有给人以“意深”之感。相对比兴来说，夸张手法的使用出现更多一些，如《陌上桑》中描绘罗敷的服饰和美貌，《焦仲卿妻》写刘兰芝辞别焦家时刻的盛妆、容貌，及篇中写府君为其儿子迎婚的排场气派，《孤儿行》中刻画孤儿的苦痛，《上邪》中女子指天发誓的话语等等。这种夸张的写法突出了事物的特征，有利于主题思想的表达，也帮助实现了作品的通俗化。（三）具有风趣和幽然感。如《长歌行》以诙谐的笔调描绘出人们想象中的神仙形象，“仙人骑白鹿，发短耳何长”。又如《步出夏门行》事与理悖，语涉荒唐，多给人以发笑逗乐之感。《陌上桑》颂赞罗敷的坚贞，谴责使君荒淫无耻，是一篇立意严肃的作品，而其表现风格却又诙谐机智，充满风趣。如从旁观者的表情动态来写罗敷的美貌，笔调十分有趣，“行者见罗敷，下担捋髭须
原载：《楚雄师专学报（社会科学版）》1995年第4期
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磷化氢对海洋微藻的影响及作用机制研究
【摘要】：磷化氢是广泛存在于海洋环境中的磷的还原性气态化合物，主要以基质结合态存在于海洋沉积物中，可动态释放到上层海水和空气中，成为一种可能的磷的补充形式。磷化氢易被氧化为磷的其他形态，可对海洋浮游植物产生影响，其参与磷的生物地球化学循环过程，对海洋中磷的循环补充具有重要意义。本论文通过室内实验，考察了磷化氢对伪矮海链藻（Thalassiosira pseudonana）细胞比增长率、高亲和力磷酸盐转运蛋白基因表达量、碱性磷酸酶活性及抗氧化酶活性的影响，从微藻细胞对磷的吸收利用的角度及氧化压力、自由基的角度，结合以往研究基础，较为系统的分析了磷化氢对海洋微藻的作用机制，以期解释磷化氢对海洋微藻的作用，为完善磷的海洋生物地球化学循环过程中磷化氢的作用和地位提供科学依据。主要结果如下：
磷化氢对微藻生长具有一定的影响，但并不能作为唯一磷源供细胞增长。磷缺乏及磷酸盐充足条件下，磷化氢对伪矮海链藻藻细胞密度及细胞比增长率的影响研究发现，低浓度的磷化氢对微藻生长有一定的刺激作用，高浓度磷化氢具有一定的抑制作用。
磷化氢具有直接作用于海洋微藻的途径，影响海洋微藻吸收利用磷的能力是磷化氢是磷化氢对海洋微藻的作用机制之一。一方面，磷缺乏条件下，伪矮海链藻碱性磷酸酶（AKP）活性随磷化氢浓度的增加先升高后下降，表明磷化氢促进了伪矮海链藻细胞的缺磷信号的表达与传导，同时其活性的升高也说明磷化氢除转化为磷酸盐被微藻利用外，可能还具有直接作用于海洋微藻的途径。另一方面，在磷缺乏及4μmol/L磷酸盐条件下，磷化氢对伪矮海链藻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因（TpPHO）基因表达具有一定的促进作用，也表明磷化氢促进了伪矮海链藻细胞的缺磷信号的表达与传导。对比研究磷化氢和相同磷浓度的磷酸盐对TpPHO基因表达量的影响发现，磷化氢处理组的TpPHO基因表达量显著大于磷酸盐处理组的TpPHO基因表达量，进一步证明磷化氢与磷酸盐对TpPHO基因的表达具有不同的作用途径，磷化氢可直接作用于藻细胞而并非完全转化为磷酸盐被吸收。因此，一定浓度的磷化氢对AKP活性和PHO基因表达具有促进作用，进而可促进微藻对磷的吸收利用，有益于细胞增长。
磷化氢对海洋微藻的作用机制之一是通过改变细胞内的活性氧水平而作用于微藻细胞的抗氧化酶系统。在本论文磷化氢的实验浓度范围内，伪矮海链藻超氧化物歧化酶（SOD）活性随磷化氢浓度的增加先升高后降低。推测磷化氢诱导细胞产生了较多的超氧阴离子自由基（O2），进一步诱导了SOD活性升高，使得细胞清除O2
的能力增强。磷化氢诱导产生的O2
被SOD歧化为过氧化氢（H2O2后，进一步诱导了伪矮海链藻的过氧化氢酶（CAT）活性，伪矮海链藻对磷化氢胁迫产生的H2O2主要依靠强化CAT的活性来清除。实验前期，磷化氢所致的氧化压力激活了伪矮海链藻抗氧化防御系统，保护细胞免受损伤，表现为磷化氢处理组伪矮海链藻细胞丙二醛（MDA）含量较对照组低；而实验后期MDA含量表现为磷化氢处理组高于对照组，说明磷化氢的作用具有一定的时间效应。伪矮海链藻细胞MDA含量与细胞比增长率呈一定的负相关关系，证明了抗氧化酶活性对磷化氢的响应是微藻细胞对磷化氢响应的一种途径。根据本文及以往研究结果，较为系统的探讨了磷化氢对海洋微藻的作用机制分析推断磷化氢对海洋微藻的作用兼具直接作用和转化为磷酸盐后被吸收利用
的两种方式。磷化氢对微藻细胞生长、抗氧化酶活性及磷代谢的影响表明了其对微藻的双重作用：一方面，低浓度磷化氢诱导抗氧化酶活性的升高，对TpPHO基因的表达及AKP活性均具有促进作用，从而对细胞增长具有一定的刺激作用；另一方面，磷化氢具有毒性，高浓度的磷化氢会对微藻的酶活性和基因表达等产生抑制作用，损伤细胞膜系统，抑制细胞增长。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（海洋研究所）【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：X145【目录】：
致谢4-6目录6-10中文摘要10-12Abstract12-15第一章 绪论15-41 1 环境中的磷化氢16-28
1.1 磷化氢的性质17-20
1.2 自然环境中磷化氢的分布特征20-25
1.3 磷化氢在海洋磷循环中的作用25-28 2 生物对磷的吸收利用28-34
2.1 浮游植物对磷的吸收利用29-30
2.2 浮游植物对磷酸盐缺乏的响应30-33
2.3 磷化氢对浮游植物的影响研究进展33-34 3 磷化氢对生物的毒性效应34-38
3.1 磷化氢对线粒体细胞色素氧化酶的影响34-35
3.2 磷化氢对动物抗氧化酶活性的影响35
3.3 浮游植物抗氧化酶系统对环境压力的响应35-38 4 拟解决的科学问题38-39 5 本研究的目的、内容和意义39-41第二章 海水中磷化氢浓度测定的基础——磷化氢的亨利常数41-55 1 前言41-42 2 材料与方法42-46
2.1 实验材料42-43
2.2 多次相平衡法测定亨利常数的原理43-44
2.3 实验方法44-46
2.4 数据分析46 3 结果46-52
3.1 天然海水中磷化氢的亨利常数46-47
3.2 不同温度条件下磷化氢的亨利常数47-48
3.3 不同盐度条件下磷化氢的亨利常数48-50
3.4 不同 pH 条件下磷化氢的亨利常数50
3.5 磷化氢亨利常数与温度和盐度的耦合关系50-52 4 讨论52-53
4.1 温度对磷化氢亨利常数的影响52
4.2 盐度对磷化氢亨利常数的影响52
4.3 海水中磷化氢浓度的测定方法52-53 5 小结53-55第三章 磷化氢对海洋微藻生长繁殖的影响55-67 1 前言55-56 2 材料与方法56-59
2.1 实验材料56-59
2.2 实验方法59 3 结果59-64
3.1 磷缺乏条件下，伪矮海链藻细胞密度和细胞比增长率（μ）随磷化氢浓度的变化59-62
3.2 磷酸盐充足（L1培养基）条件下，伪矮海链藻细胞密度和细胞比增长率随磷化氢浓度的变化62-64 4 讨论64-65
4.1 磷缺乏条件下,磷化氢对伪矮海链藻生长繁殖的影响64-65
4.2 磷酸盐充足条件下,磷化氢对伪矮海链藻生长繁殖的影响65 5 小结65-67第四章 微藻磷酸盐转运蛋白基因表达及碱性磷酸酶活性对磷化氢的响应特征67-93 1 前言67-69 2 材料与方法69-78
2.1 实验材料69-70
2.2 实验方法70-77
2.7 数据处理77-78 3 结果78-88
3.1 不同磷酸盐及磷化氢处理下，伪矮海链藻的生长78-81
3.2 TpPHO 基因与 18S rRNA 的扩增效率81-83
3.3 不同磷化氢处理下 TpPHO 基因表达量的变化83-87
3.4 不同磷化氢处理下伪矮海链藻 AKP 活性的变化87-88 4 讨论88-91
4.1 伪矮海链藻 PHO 基因表达对磷化氢的响应特征88-90
4.2 伪矮海链藻 AKP 活性对磷化氢的响应特征90-91 5 小结91-93第五章 海洋微藻抗氧化酶活性对磷化氢的响应特征93-107 1 前言93-94 2 材料与方法94-99
2.1 实验材料94-96
2.2 实验方法96-99
2.3 数据处理99 3 结果99-103
3.1 不同磷化氢浓度下伪矮海链藻细胞比增长率的变化99-100
3.2 不同磷化氢浓度下伪矮海链藻抗氧化酶活性变化100-102
3.3 磷化氢处理后伪矮海链藻丙二醛（MDA）含量的变化102-103 4 讨论103-106
4.1 磷化氢胁迫下，伪矮海链藻抗氧化酶活性的响应103-105
4.2 磷化氢胁迫下，伪矮海链藻抗氧化酶活性、MDA 含量变化与藻细胞生长特征的关系105-106 5 小结106-107第六章 磷化氢对海洋微藻作用机制的探讨107-111 1 部分磷化氢转化为生物可利用的磷酸盐107 2 磷化氢对海洋微藻生长的影响107-108 3 磷化氢对海洋微藻磷酸盐吸收利用的影响108-109 4 从自由基的角度，探讨磷化氢对海洋微藻的作用109-111第七章 总结与展望111-114 1 总结111-113 2 创新点113 3 不足及展望113-114参考文献114-133作者简历133-134博士期间发表论文及专利134
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